Yenidoğan ratlarda hipoksik iskemik ensefalopati modelinde pentoksifilin ve melatonin tedavisinin etkinliği

Abstract

Perinatal asfiksi yenidoğan döneminde mortaliteye, motor-bilişsel kayıplar ve epilepsi gibi ciddi komplikasyonlara neden olan önemli bir sorundur. Hipoksi-iskemi sonrası nöron ölümü ile sonlanan süreç enerji yokluğu ile başlamakta, hücre içi kalsiyum birikimi, glutamat salınımı ve NMDA reseptörleri uyarılması ile devam etmektedir. Hücre içinde kalsiyum artışı ile kalsiyum bağımlı lipaz, proteaz ve fosfolipazlar aktive olmakta, ksantin ve prostaglandin sentezi sırasında oluşan serbest oksijen radikalleri hücre hasarına yol açmaktadır. Hücrede enerji yetmezliği, asidoz, glutamat salınımı, hücre içi kalsiyum artışı, lipid peroksidasyonu ve nitrik oksit oluşumu sonucunda ana hücresel bileşenler hasar görmekte; nekroz ve apopitoz ile hücre ölümü gerçekleşmektedir. Pineal bezde sentezlenen melatonin serbest radikal bağlayıcı ve antioksidan enzim aktivitelerini artıran güçlü bir antioksidandır. Apopitoz önleyici etkinliği olduğu bilinmektedir. Pentoksifilin bir ksantin türevidir. TNF- ' üretimini ve apopitozu engellemektedir. Çalışmada melatonin ve pentoksifilin tedavisinin yenidoğan rat hipoksik iskemik beyin hasarı modelinde nöron hasarı ve beyin nitrik oksit üretimi üzerine olan etkilerini araştırmayı amaçladık. Çalışmada yedi günlük Wistar Albino suşu yavru ratlar kullanıldı (n=60). Denekler; kontrol grubu, melatonin ile tedavi edilen hipoksi-iskemi grubu, pentoksifilinle tedavi edilen hipoksi-iskemi grubu, melatonin+pentoksifilinle tedavi edilen hipoksi-iskemi grubu, etanol (melatonin çözücüsü) verilen hipoksi-iskemi grubu ve salin verilen hipoksi-iskemi grubu olarak ayrıldı. Hipoksi iskemi uygulanan gruplardaki hayvanların, doğum sonrası yedinci günde sol ana karotis arterleri kalıcı olarak bağlandı. Cerrahi işlemden iki saat sonra 2.5 saat süre ile hipoksik gaz karışımı (%92 azot ve %8 oksijen) solutularak hipoksi oluşturuldu. Melatonin (10 mg/kg), pentoksifilin (40 mg/kg) ve pentoksifilin+melatonin hipoksiden hemen sonra tek doz olarak periton içine (i.p.) uygulandı. Hipoksik iskemik uygulamadan 72 saat sonra deneklerin beyin nitrit düzeyleri, hipokamus nöron sayısı ve apopitotik hücre oranları değerlendirildi.Histopatolojik değerlendirmede melatonin ve pentoksifilin tedavisi almış gruplarda hipokampus da apopitotik hücre sayılarında anlamlı azalma saptandı. Melatoninin tek başına uygulandığı grupta hipokampusun sadece CA2 bölgesindeki nöron sayılarında anlamlı düzeyde korunma mevcuttu. Melatonin ve pentoksifilin kombine tedavisinin, hipoksi iskemi grubu ile karşılaştırıldığında, hipokampus CA1, CA2, CA3 ve GD bölgelerindeki nöron sayılarını anlamlı düzeyde koruduğu ve apopitotik hücre oranlarını azalttığı saptandı. Hipoksik iskemik olay sonrası nitrik oksit düzeylerinde belirgin artış olduğu Griess reaktifi ile ölçülen beyin nitrit düzeyi ile gösterildi. Melatonin+pentoksifilin tedavisi ile hipoksi-iskemiye maruz kalan hemisferde nitrik oksit üretiminin belirgin azaldığı izlendi. Hipoksi iskemi grubu ile kontrol gruplarında böyle bir farklılık gözlenmedi. Bu sonuçlar yenidoğan rat hipoksik iskemik beyin hasarında melatonin ve pentoksifilin kombine tedavisinin nöron koruyucu etkinliği olduğunu göstermektedir. Bilgilerimize göre bu çalışma, melatonin ve pentoksifilin kombine tedavisinin gelişmekte olan beyinde hipoksi iskeminin oluşturduğu hasardan koruyucu etkinliğini gösteren ilk çalışmadır.

Perinatal asphyxia is an important cause of neonatal mortality and subsequent serious sequelae such as motor and cognitive deficits and seizures. The principal mechanisms leading to neuronal death after hypoxia-ischemia are initiated by energy depletion, accumulation of extracellular glutamate, and activation of glutamate receptors. The cascade of events that follows involves accumulation of cytosolic calcium and activation of a variety of calcium-mediated deleterious events, such as activation of lipases, proteases and phospholipases, and formation of oxygen free radicals as by-products of xantine and prostaglandin synthesis. The intracellular calcium induces the production of nitric oxide. The combined effects of cellular energy failure, acidosis, glutamate release, intracellular calcium accumulation, lipid peroxidation, and NO neurotoxicity disrupt essential components of the cell, resulting in death by mechanisms of necrosis and apoptosis. Melatonin, the chief secretory product of the pineal gland, is an effective antioxidant which scavenges free radicals and up-regulates several antioxidant enzymes. It also has a strong anti-apoptotic signaling function. Pentoxyphilline is a xanthine derivative, potent inhibitor of TNF- ' production and apoptosis. The aim of this study is to investigate the effects of the melatonin and pentoxyphilline on neurodegeneration and cerebral nitric oxide production in a neonatal rat model of hypoxic-ischemic brain injury. Seven-day-old Wistar Albino rat pups have been used in the study (n=60). Experimental groups in the study were; sham operated group, melatonin treated hypoxia-ischemia group, pentoxyphilline treated hypoxia-ischemia group, melatonin+pentoxyphilline treated hypoxia-ischemia group, etanole (melatonin 's dissolver) treated hypoxia-ischemia group and vehicle-treated hypoxia-ischemia group. In hypoxia-ischemia groups, left common carotid artery was ligated permanently on the seventh postnatal day. Two hours after the procedure, hypoxia (%92 nitrogen and %8 oxygen) was applied for 2.5 hour. Melatonin (10 mg/kg), pentoxyphilline (40 mg/kg) and melatonin+pentoxyphilline were injected (intraperitoneally; ip) as a single dose immediately after the hypoxia period. Brain nitrite levels, neuronal cell death, and apoptosis were evaluated 72 hours after the hypoxic-ischemic insult. Histopathological evaluation demonstrated that melatonin and pentoxyphilline significantly diminished number of 'apoptotic cells ' in the hippocampus. Melatonin, when administered separately, significantly preserved the number of neurons only in the CA2 regions of hippocampus. When compared with vehicle-treated group, combination treatment with melatonin and pentoxyphilline significantly reduced 'apoptotic cell death ' and preserved the number of neurons CA1, CA2, CA3, and dentate gyrus regions of hippocampus. Brain nitrite levels were evaluated by Griess reagent and showed that hypoxic-ischemic injury caused a significant increase in NO production. Melatonin+pentoxyphilline treatment significantly decreased NO overproduction in the hypoxic-ischemic hemisphere, whereas no significant change appeared in hypoxia alone and also in the sham-operated group. These results suggest the beneficial neuroprotective effect of melatonin and pentoxyphilline combination treatment in this model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. To our knowledge, this is the first study that demonstrates a protective effect of melatonin and pentoxyphilline combination treatment against hypoxia-ischemia in the developing brain.