Fitaz üreten fungusdan enzimin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Adnan Menderes Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı stok kültürlerinde kayıtlı havadan ve topraktan izole edilmiş 165 adet fungus fitaz enzimi üretme kapasitesi açısından taranmıştır. Aspergillus niger UA-D suşunun en yüksek aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır. Aspergillus niger UA-D suşundan ekstraselüler olarak PSM ortamında üretilen fitaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE Sefaroz CL-6B ve Fenil Sepharoz CL-4B işlemleri uygulanarak % 2.6 verimle 73 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE elektroforezinde tek bant elde edilmiş ve moleküler ağırlığı 65 kDa olarak hesaplanmıştır. Maksimum aktivitesini pH 3.0 ve 70 oC sergilediği bulunmuştur. Enzimin geniş bir sıcaklık ve pH aralığında stabil olduğu saptanmıştır. Enzimin fitik asit için Km değeri 180 µM ve Vmax değeri 54.35 U/mL olarak hesaplanmıştır. Fitaz enziminin geniş bir substrat spesifikliğine sahip olduğu belirlenmiştir. Fitaz aktivitesi, Ba2+ ve Li+ tarafından artarken, Fe2+, Al3+ ve Pb2+ tarafından inhibe olmuştur. Enzim aktivitesi NBS, PMSF, DTNB, 2,3-bütandion varlığında oldukça inhibe olurken, CMC, DTT ve ß-merkaptoetanol ile aktive olmuştur. Bu sonuçlar enzimin katalitik merkezinde triptofan, sistein, serin ve arjinin rezidülerinin önemli rol oynadığı sonucuna varılmıştır. Polihidrik alkollerden gliserol ve sorbitolün sıcaklık stabilitesini artırdığı ve organik çözücülerin ise enzim aktivitesini çok fazla etkilemediği belirlenmiştir.

Fungal strains that were isolated from air and soil and registered in Adnan Menderes University Department of Biology culture stocks were screened for phytase activity of 165 fungal strains. Aspergillus niger UA-D. strain showed the highest phytase activity. Extracellular phytase produced by Aspergillus niger in PSM was purified 73-fold with a recovery of % 2.6 referred to the phytase activity in the crude extract using, ammonium sulphate precipitation, DEAE Sepharose CL-6B and Phenyl Sepharose CL-4B. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified enzyme gave a single stained band at a molecular mass of approximately 65 kDa. The temperature and pH for maximum activity of the enzyme were 70 oC and 3.0, respectively. Km and V max values for phytic acid of the enzyme were calculated to be, 180 µM and 54.35 U/mL, respectively. The phytase exhibited broad substrate specificity. The enzyme was stimulated by Ba2+ and Li+ and strongly inhibited by Fe2+, Al3+ and Pb2+ The enzyme activity was markedly inhibited in the presence of NBS, PMSF, DTNB, 2,3-butanedione suggesting that tryptophan, cysteine, arginine and serine residues play an important role in the catalytic process. Glyserol and sorbitol enhance thermostability of phytase. The enzyme was detemined to be highly stable against organic solvents.