İmmobilize metal afinite kromatografisi ile maya alkol dehidrogenaz enziminin saflaştırılması

Abstract

Bu tezde, poli(2-hidroksietil metakrilat-glisidilmetakrilat) [poli(HEMA-GMA)] kriyojelleri, HEMA ve fonksiyonel komonomer GMA'nın çapraz bağlayıcı olarak N,N'-metilen bisakrilamid (MBAAm) kullanılarak radikalik kriyokopolimerizasyon ile hazırlanmıştır. İminodiasedik asit (IDA) fonksiyonel grupları, poli(HEMA-GMA) kriyojellerindeki epoksi gruplarının halka yapılarının açılmasıyla kriyojellere bağlanmış ve daha sonra Zn2+ iyonları ile şelatlaştırılmıştır. Kriyojeller FTIR, SEM, EDX ve şişme çalışmaları ile karakterize edilmiştir. Bu kriyojeller 30-50 'm büyüklüğünde birbirine bağlı gözeneklere sahiptir. Zn2+ ile şelatlaştırılmış poli(HEMA-GMA)-IDA kriyojellerinin denge şişme derecesi yaklaşık % 600'dür. Zn2+ ile şelatlaştırılmı şpoli(HEMA-GMA)-IDA kriyojelleri sulu çözeltiden alkol dehidrogenaz adsorpsiyonu için kullanılmış ve adsorpsiyon sürekli sistemde gerçekleştirilmiştir. Adsorpsiyona pH, alkol dehidrogenaz derişimi, sıcaklık, iyonik şiddet ve akış hızının etkisi araştırılmıştır. Maksimum alkol dehidrogenaz miktarı, 1,0 mg/mL alkol dehidrogenaz derişiminde ve 0,5 mL/dak akış hızındaki pH 5,0 asetat tamponunda 9,94 mg/g polimer olarak bulunmuştur. Adsorplanan alkol dehidrogenazın desorpsiyonupH 8,0 fosfat tamponunda 1,0 M NaCl içerisinde gerçekleştirilmiş ve % 93,5 olarak bulunmuştur. Ayrıca bu kriyojeller tek bir adımda mayadan alkol dehidrogenaz saflaştırılmasında kullanılmıştır. Desorbe edilen alkol dehidrogenazın saflığı gümüş ile boyanmış SDS-PAGE ile gösterilmiştir. Bu saflaştırma işlemi ham maya homojenatından alkol dehidrogenaz enziminin saflaştırılması için başarılı bir şekilde kullanılabilir.

In this thesis, poly(2-hydroxyethyl methacrylate-glycidyl methacrylate) [poly(HEMA-GMA)] cryogels were prepared by radical cryocopolymerization of HEMA with GMA as a fonctional comonomer and N,N'-methylene-bisacrylamide(MBAAm) as a crosslinker. Iminodiacetic acid (IDA) fonctional groups were attached via ring opening of the epoxy group on the poly(HEMA-GMA) cryogels and then Zn2+ ions were chealeted with this structures. Characterization of cryogels was performed by FTIR, SEM, EDX and swelling studies. These cryogels have interconnected pores of 30-50 µm size. The equilibrium swelling degree of Zn2+ chealeted poly(HEMA-GMA)-IDA cryogels was approximately 600%. Zn2+ chealeted poly(HEMA-GMA)-IDA cryogels were used in the adsorption of alcohol dehydrogenase from aqueous solutions and adsorption was performed in continuous system. The effects of pH, alcohol dehydrogenase concentration, temperature, ionic strengt hand flow rate on adsorption were investigated. The maximum amount of alcohol dehydrogenase adsorption wasd etermined to be 9,94 mg/g cryogel at 1,0 mg/mL alcohol dehyrogenase concentration and acetate buffer at pH 5,0 with flow rate of 0,5 mL/min. Desorption of adsorbed alcohol dehyrogenase was carried out by 1,0 M NaCI at pH 8,0 phosphate buffer and desorption rate was found to be 93,5 %. Additionally, these cryogels was used for purification of alcohol dehydrogenase from yeast with a single-step. The purity of desorbed alcohol dehydrogenase was shown by silver-stained SDS-PAGE. This purification process can successfully be used for the purification of alcohol dehydrogenase from unclarified yeast homogenates.