Rekombinant MrkD Proteininin Fibroblast Hücresine Ve Kolajene Adezyondaki  Rolünün Belirlenmesi

DSpace Home
→
Tez
→
Yüksek Lisans
→
View Item

dc.contributor.advisor	Bozdoğan, Bülent
dc.contributor.author	Orbayoğlu, Asya Gülistan
dc.date.accessioned	2025-08-22T08:05:49Z
dc.date.available	2025-08-22T08:05:49Z
dc.date.issued	2025
dc.date.submitted	2025
dc.identifier.citation	Orbayoğlu, A. G. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoteknoloji, Yüksek Lisans tezi Aydın, 2025	tr_TR
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11607/5391
dc.description.abstract	ÖZET REKOMBİNANT MRKD PROTEİNİNİN FİBROBLAST HÜCRESİNE VE KOLAJENE ADEZYONDAKİ ROLÜNÜN BELİRLENMESİ Orbayoğlu, A. G. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoteknoloji, Yüksek Lisans tezi Aydın, 2025 Amaç: Bu tezde, rekombinant olarak üretilen MrkD proteininin insan fibroblast hücreleri ve kolajenle olan etkileşimi moleküler düzeyde incelenmiş, bu proteinin potansiyel terapötik hedef olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Rekombinant DNA teknolojisi ile K. pneumoniae'nin mrkD geninin çoğaltılması için primerler tasarlanmış ve çoğaltılan gen pET30a(+) ekpresyon vektörüne klonlanmıştır ardından E. coli BL21 hücrelerine transforme edilmiştir. MrkD proteini IMAC yöntemi ile saflaştırılmış, fibroblast hücre hattına karşı sitotoksitesi ve K. pneumoniae’nin hücreye bağlanabilme potansiyelindeki etkisi incelenmiştir. Ayrıca MrkD proteininin Tip V kolajen ile olan etkileşim değerleri ELISA yöntemi ile ölçülmüştür. Bulgular: Saflaştırılan MrkD proteininin boyu 40.8 kDa olarak hesaplanmıştır. MrkD proteinin tip V kolajen ile etkileşim gösterdiği ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır. Proteinin BJ fibroblast hücrelerine dair herhangi bir sitotoksik etkisinin olmadığı Wst-1 yöntemi ile belirlenmiştir. MrkD proteini K. pneumoniae’nin Bj hücrelerine bağlanma potansiyelini yaklaşık 0,85 log azaltmıştır. Sonuç: Bu çalışma kapsamında, BJ insan fibroblast hücreleriyle MrkD proteini arasında gerçekleşen etkileşim ilk kez deneysel olarak ortaya konmuş ve protein yapısının sitotoksik potansiyeli doğrudan analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçların, MrkD proteininin kolajenle ilişkisini açıklığa kavuşturması ve tedavi hedefi olabilecek yapılar için yol gösterici olması beklenmektedir.	tr_TR
dc.description.tableofcontents	İÇİNDEKİLER KABUL ONAY…………………………………………………………………………………i TEŞEKKÜR .......................................................................................................................... ii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ .......................................................................... vii ŞEKİLLER DİZİNİ .............................................................................................................. ix RESİMLER DİZİNİ ............................................................................................................... x TABLOLAR DİZİNİ ............................................................................................................ xi ÖZET .................................................................................................................................. xii 1.GİRİŞ ................................................................................................................................. 1 2. GENEL BİLGİLER ........................................................................................................... 3 2.1.ESKAPE Patojenleri ........................................................................................................ 3 2.2.K. pneumoniae ................................................................................................................. 4 2.2.1. Tarihçesi ve Taksonomisi ............................................................................................. 4 2.2.1. Morfolojisi ................................................................................................................... 5 2.2.3. K. pneumoniae’nin Virülans Faktörleri ......................................................................... 6 2.2.4. Epidemiyolojisi .......................................................................................................... 10 2.3.K. pneumoniae enfeksiyon kaynaklı hastalıkları: ............................................................ 12 2.3.1.1. Tedavisi ve Antibiyotik direnci ................................................................................ 13 2.4. Tedavi Yaklaşımlarında Adezyon Mekanizmalarının Hedeflenmesi .............................. 14 2.4.1. Adezyon Proteinleri .................................................................................................... 14 2.4.2. Adezyon ve Enfeksiyon Arasındaki İlişki ................................................................... 15 2.5.MrkD Adezini: ............................................................................................................... 16 2.6.Rekombinant DNA Teknolojileri ................................................................................... 17 2.GEREÇ VE YÖNTEM ..................................................................................................... 20 3.1. Gereç ............................................................................................................................ 20 v 3.1.1. Cihazlar ...................................................................................................................... 20 3.1.2. Besiyerleri Çözeltiler ve Tamponlar ........................................................................... 21 3.2. Yöntem ......................................................................................................................... 26 3.2.1 K. pneumoniae mrkD genine spesifik primer tasarımı .................................................. 26 3.2.2. mrkD Geninin PZR ile Çoğaltılması ve Elektroforez .................................................. 28 3.2.3. mrkD Geninin pET30-a(+) Plazmidine Klonlanması ................................................... 29 3.2.3.1. Restriksiyon ............................................................................................................ 29 3.2.3.2. Prespitasyon ............................................................................................................ 30 3.2.3.3. Ligasyon ................................................................................................................. 30 3.2.3.4. Kompetan Hücrenin Hazırlanması ........................................................................... 31 3.2.3.5. Transformasyon ....................................................................................................... 31 3.2.3.6. İnsert Alan Rekombinant Plazmidleri İçeren Kolonilerin Seçimi ve Doğrulanması .. 32 3.2.3.7. Sekans Analizi ......................................................................................................... 32 3.2.4. Protein Analizi ........................................................................................................... 32 3.2.4.1. Rekombinant MrkD proteinin indüklenmesi ve SDS-PAGE jel ile gösterilmesi ....... 32 3.2.4.2. rMrkD’nin E.coli BL21 hücrelerinde kültürlenmesi ................................................. 33 3.2.4.3. IMAC yöntemi ile rMrkD’nin Saflaştırılması ve SDS-PAGE ile Gösterilmesi ......... 34 3.2.4.4. Protein Konsantasyonunun Belirlenmesi .................................................................. 34 3.2.5. Tip V Kolajen ve rMrkD Proteini Arasındaki Etkileşimin ELISA ile Doğrulanması ... 35 3.2.6.1. Fibroblast BJ Hücre Hattının Kültürlenmesi ............................................................ 36 3.2.6.2. Hücre Canlılığı Testi ............................................................................................... 36 3.2.6.3. MrkD Proteininin Fibroblast BJ Hücrelerine Bağlanmasının K. pneumoniae Bağlanmasına Etkisi ............................................................................................................. 37 4. BULGULAR.................................................................................................................... 38 4.1. mrkD genin PZR sonucu ............................................................................................... 38 4.2. mrkD amplikonun pET30a-(+) vektörüne klonlanması ve transformasyonu ................... 39 4.3.1.İnsert alan rekombinant plazmidleri içeren kolonilerin seçimi ve doğrulanması ........... 40 vi 4.3.2.T7 primerleri PZR kurulması ve DNA Dizi Analizi ve Karşılaştırma Sonucu .............. 41 4.3.3.Şematik olarak MrkD’nin pET30a-(+) vektörüne klonlanması ..................................... 43 4.4.1.rMrkD’nin protein ekspresyonu sonucu ....................................................................... 44 4.4.2.rMrkD’nin IMAC yöntemi ile saflaştırılması sonucu ................................................... 45 4.5. Tip V Kolajen ve rMrkD Proteini Arasındaki Etkileşimin ELISA ile İncelenmesi ......... 45 4.6.BJ Fibroblast Hücre Hattının Kültürlenmesi ................................................................... 48 4.6.1.Thoma Lamı Kullanılarak Hücrelerin Sayılması .......................................................... 49 4.6.2.Hücre Canlılığı Testi ................................................................................................... 49 4.6.1 MrkD Proteininin Fibroblast BJ Hücrelerine Bağlanmasının K. pneumoniae Bağlanmasına Etkisinin İncelenmesi .................................................................................... 52 5.TARTIŞMA ...................................................................................................................... 56 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ................................................................................................. 62 KAYNAKLAR .................................................................................................................... 63 BİLİMSEL ETİK BEYANI ................................................................................................. 73 ÖZGEÇMİŞ ......................................................................................................................... 74	tr_TR
dc.language.iso	tur	tr_TR
dc.publisher	T.C. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü	tr_TR
dc.rights	info:eu-repo/semantics/openAccess	tr_TR
dc.subject	K. pneumoniae, MrkD, Adezin, Rekombinant DNA Teknolojileri	tr_TR
dc.title	Rekombinant MrkD Proteininin Fibroblast Hücresine Ve Kolajene Adezyondaki Rolünün Belirlenmesi	tr_TR
dc.type	masterThesis	tr_TR
dc.contributor.department	T.C. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı	tr_TR