Rekombinant Faj Tail Proteinlerinin Bakterilere Adezyonundaki Rollerinin Araştırılması

Abstract

Amaç: Proteus mirabilis ve Proteus vulgaris, özellikle kateter ilişkili üriner sistem enfeksiyonları (CAUTI), piyelonefrit, sepsis ve taş oluşumu gibi ciddi klinik tablolarda rol alan önemli fırsatçı patojenlerdir. Bu bakterilerin sahip olduğu yüzey yapıları, biyofilm oluşturma kapasitesi ve artan antibiyotik direnci, enfeksiyonların tanı ve tedavisini güçleştirmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı, P. mirabilis RP6 ve P. vulgaris RP7 bakteriyofajlarından elde edilen reseptör bağlayıcı proteinler (RBP), Gp35 ve Gp106’nın rekombinant üretimi ve tanısal potansiyellerinin detaylı olarak değerlendirilmesidir. Çalışma, bu proteinlerin özgüllük, duyarlılık, bağlanma spektrumu, biyolojik örneklerdeki performansı, faj adsorpsiyonunu engelleme kapasitesi ve antibakteriyel/sitotoksik etkileri bakımından karakterize edilmesini hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Gp35 ve Gp106 proteinlerini kodlayan gen dizileri, spesifik primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiş ve elde edilen amplikonlar pET-30a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlama işlemi doğrulandıktan sonra, rekombinant proteinler Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilmiş ve Ni-NTA afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan RBP’lerin Proteus spp.’ye özgü bağlanma kapasiteleri kristal viyole boyama ve ELISA yöntemleriyle analiz edilmiştir. Farklı bakteri yoğunluklarıyla gerçekleştirilen C-ELISA deneyleri ile RBP’lerin tespit limitleri belirlenmiş, bağlanma spektrumları ise 49 klinik izolat ile test edilmiştir. Ayrıca, idrar gibi biyolojik ortamlarda bağlanma performansı test edilmiş ve rekombinant proteinlerin fajlar ile aynı reseptör bölgelerine bağlanıp bağlanmadığı rekabetçi adsopsiyon deneyleri ile ortaya konmuştur. Rekombinant proteinlerin antibakteriyel etkisi spot-test analizi ile, sitotoksisite ise insan fibroblast hücrelerinde WST-1 yöntemiyle belirlenmiştir. Bulgular: Gp35 ve Gp106 proteinleri yalnızca Proteus spp. izolatlarına bağlanmış, heterolog bakterilere (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) karşı sinyal üretmemiştir. C-ELISA tabanlı duyarlılık analizlerinde her iki protein de ≈10³ CFU/mL sınırında hedefe özgül bağlanma gösterebilmiştir. Bağlanma spektrumu analizinde Gp35’in Proteus izolatlarının %82,5’ine, Gp106’nın ise %90’ına bağlandığı saptanmış; bu durum Gp106’nın daha geniş bir konak aralığına sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bazı izolatlarda Gp35 ve Gp106 bağlanmasına rağmen ilgili fajların enfekte edememesi, RBP’lerin tanı platformlarında fajlara göre daha geniş spektrum sunabileceğini ortaya konmuştur. Biyolojik örneklerde yapılan testlerde RBP’ler, idrar ortamında özgüllüklerini koruyarak hedef bakterilere başarıyla bağlanmıştır. Rekabetçi faj adsorpsiyon testlerinde ise Gp35 ve Gp106’nın, RP6 ve RP7 fajlarının hedef hücrelere bağlanmasını %65–80 oranında engellediği belirlenmiştir. Bu sonuç, her iki proteinin de fajların bağlandığı özgül reseptörlere yöneldiğini ve bu reseptörleri işgal ederek faj enfeksiyonunu baskılayabildiğini göstermiştir. Son olarak, her iki RBP’nin de uygulandığı bakterilerde herhangi bir antibakteriyel etki gözlemlenmemiş, dolayısıyla yalnızca hedef tanıma ve bağlanma işlevi gördükleri belirlenmiştir. Ayrıca, bu iki rekombinant proteinin insan fibroblast (BJ) hücre hattı üzerinde de herhangi bir sitotoksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Sonuç: Bu tez çalışması, Proteus spp.’ye özgül rekombinant RBP’lerin ilk sistematik karakterizasyonunu sunmaktadır. Gp35 ve Gp106, tanı uygulamalarında kullanılmak üzere yüksek özgüllük, geniş spektrum, klinik örnek uyumluluğu ve hedef reseptör doğruluğu gibi özellikleri bir arada taşıyan adaylardır. Antibakteriyel veya sitotoksik etkiler göstermemeleri sayesinde, canlı hücre tespiti gereken uygulamalarda güvenle kullanılabilirler Literatürde benzer örnekleri bulunan RBP-temelli tanı sistemleriyle karşılaştırıldığında, bu çalışma, Proteus spp. enfeksiyonlarının hızlı, duyarlı ve özgül teşhisinde kullanılabilecek biyo-tanıma platformları için önemli bir temel oluşturmaktadır. Ayrıca, bu reseptör bağlayıcı proteinler, yalnızca tanı amaçlı değil, aynı zamanda hedefe yönelik tedavi stratejilerinde, örneğin nanopartiküllere bağlanarak antimikrobiyal ajanların hedefe taşınmasında da kullanılabilecek biyolojik araçlar olarak öne çıkmaktadır.