Amaç: Romatoid artrit patogenezinden sorumlu peptidil arjinin deiminaz 4 enziminin aktivitesini azaltmaya yönelik değişken ağır zincir (VH; variable heavy chain) yapıda rekombinant inhibitor geliştirmektir.
Gereç ve Yöntem: PAD4 geninin E. coli’ye göre kodon optimizasyonu yapıldı ve sentezlettirildi. Sentezlenen PAD4 geni pET-30a vektörüne klonlandı ve E. coli BL21 (DE3)’e aktarıldı, PAD4 proteininin rekombinant üretimi gerçekleştirildi ve IMAC ile saflaştırıldı. Saflaştırılan PAD4 ile CD-1 fareler immunize edildi. İmmünize fare dalakları alındı ve total RNA izolasyonu yapıldı. Ardından, cDNA sentezi ve VH amplifikasyonu gerçekleştirildi. VH amplikonları çalışmada konstrüksiyonu gerçekleştirilen pComb3-hy vektörüne klonlandı ve E. coli XL1-Blue’ya aktarılarak VH kütüphanesi oluşturuldu. VH kütüphanesini içeren bakteri kültürü M13K07 fajı ile enfekte edildi ve VH gösteren faj kütüphanesi elde edildi. VH kütüphanesinden PAD4’e afinite gösteren VH gösteren fajlar panning ile seçildi. Afinite gösteren VH’ın sekans analizi yapıldı. Elde edilen VH4’ün amino asit sekansı kullanılarak üç boyutlu yapısı belirlendi ve PAD4 ile etkileşimini araştırmak için Alphafold ile modelleme yapıldı. VH4’ün PAD4’ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonu floresans tabanlı izleme ile in-vitro olarak test edildi. VH4’ün PAD4’ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonunun HeLa memeli hücre hattına morfolojik etkisi üzerinden değerlendirildi. VH4’ün sitotoksisite deneyi HeLa hücreleri ile WST-1 kullanılarak yapıldı.
Bulgular: Çalışmada, koloni PCR ve sekans analizi sonucunda PAD4’ün klonlandığı doğrulandı. SDS-PAGE analizinde 75 kDa civarı bant eldesi neticesinde rekombinant PAD4 üretimi ve saflaştırılması doğrulandı. PAD4’e karşı oluşturulan VH gösterimi yapan faj kütüphanesinden PAD4’e afinite gösteren bir fajın kodladığı VH sekansı belirlendi. VH4 adı verilen bu peptidin moleküler ağırlığının 13 kDa ve in-silico olarak PAD4 ile 6 tane hidrojen bağı oluşturduğu gösterildi. In-vitro deneylerde VH4’ün PAD4 aktivitesini %30 azalttığı ve memeli hücre hattıyla yapılan in-vitro deneylerde PAD4 kaynaklı morfolojik bozukluğu önlediği ve sitotoksik etkiye sebep olmadığı gösterildi.
Sonuç: Bu çalışmada sitrülinleme aktivitesi ile romatoid artritin patogenezinde önemli bir role sahip olan PAD4 enzimine karşı VH yapıda rekombinant inhibitor geliştirildi. Bu inhibitörün amino asit sekansı, üç boyutlu yapısı ve PAD4 ile etkileşimi gösterildi. Rekombinant PAD4 inhibitörü VH4’ün romatoid artrit tedavisinde kullanılma potansilyelinin belirlenmesi için hayvan modellerinde etkinliğinin test edilmesi dahil ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
Purpose: To develop a recombinant inhibitor based on VH (variable heavy chain) model to reduce the activity of the PAD4 enzyme responsible for the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
Materials and Methods: PAD4 gene was synthesized after optimisation of the sequence for E. coli . The synthesized PAD4 gene was cloned into the pET-30a vector and transferred into E. coli BL21 (DE3), recombinantly produced PAD4 protein was purified by IMAC. CD-1 mice were immunized with purified PAD4 protein. Immunized mouse spleens were removed,total RNA was isolated. cDNA synthesis and VH amplification were done using primers for VH amptification. VH amplicons were cloned into the pComb3-hy vector constructed in the study and transferred into E. coli XL1-Blue to create a VH library. The bacteria containing the VH library in pComb3-hy vector were infected with M13K07 phage and the VH-displaying phage library was obtained. VH-expressing phages with affinity for PAD4 from the VH library were selected by panning. Sequence analysis was done for one of the VH showing affinity for PAD4 named as VH4. A three-dimensional structure was obtained using the amino acid sequence of VH 4 and modeling was performed to investigate its in silico interaction with PAD4. Inhibition of the citrullinating activity of PAD4 by VH4 was tested in-vitro by fluorescence-based monitoring. The morphological effect of VH4 inhibition of the citrullinating activity of PAD4 on the HeLa mammalian cell line was evaluated. The cytotoxicity assay of VH4 was performed with HeLa cells using WST-1.
Results: Cloning of PAD4 was confirmed by colony PCR and sequence analysis of the insert. Production and purification of recombinant PAD4 was confirmed by obtaining a band around 75 kDa in SDS-PAGE analysis. The phage with affinity for PAD4 was obtained from the VH display phage library created against PAD4. The molecular weight of this VH named as VH4 is 13 kDa and in silico analysis showed that it forms 6 hydrogen bonds with PAD4. It was shown to reduce citrullinating activity of PAD4 by 30% in in-vitro experiments, and in experiments with a mammalian cell line, it prevented PAD4-induced morphological disorder and did not cause cytotoxic effects.
Conclusion: In this study a recombinant inhibitor of PAD4 was obtained, which is important in the pathogenesis of rheumatoid arthritis with its citrullination activity. Using amino acid sequence of the recombinant inhibitor of PAD4, three-dimensional structure and in silico interaction of this inhibitor with PAD4 were shown. Further studies including animal model studies should be done to investigate its potential to be used for treatment of rheumatoid arthritis.
