Aspergillus tubingensis tarafından üretilen fitaz enziminin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Aspergillus tubingensis HBF 202 suşundan ekstrasellüler olarak PSM ortamında üretilen fitaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, Fenil Sepharoz CL-4B, DEAE Sefaroz CL-6B ve Sefadeks G-100 işlemleri uygulanarak % 7.24 verimle 101 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE de tek bant elde edilmiş ve moleküler ağırlığı 63.48 kDA olarak hesaplanmıştır. Maksimum enzim aktivitesi pH 2.50 ve 60°C bulunmuştur. Enzimin geniş bir sıcaklık ve pH aralığında stabil olduğu saptanmıştır. Enzimin sodyum fitat için Km değeri 267 μM, ve Vmax değeri 109.89 U/mL olarak hesaplanmıştır. Fitaz enziminin geniş bir subsrat spesifikliğine sahip olduğu belirlenmiştir. Fitaz aktivitesi, Ba2+ ve Li+ katyonları tarafından artarken, Fe2+, Al3+ ve Pb2+ katyonları tarafından inhibe olmuştur. Enzim NBS, PMSF, DTNB ve 2,3-bütandion tarafından inhibe edilmiştir. Ancak enzim CMC, DTT, ve β- merkaptoetanol ile aktive olmuştur. Bu sonuçlar enzimin katalitik merkezinde triptofan, sistein, serin ve arjinin kalıntılarının önemli rol oynadığı sonucuna varılmıştır. Polihidrik alkollerden yalnızca sorbitolün sıcaklık stabilitesini artırdığı ve organik çözücülerin ise enzim aktivitesini çok fazla etkilemediği belirlenmiştir. Extracellular phytase produced by Aspergillus tubingensis HBF 202 in PSM was purified 101 - fold with a recovery of % 7,24 referred to the phytase activity in the crude extract using, amonium sulphate precipitation, Phenly Sepharose CL-4B, DEAE Sepharose CL-6B and Sephadex G-100. SDS-PAGE of the purrified enzyme gave a single stained band at a molecular mass of approximately 63.48 kDa. The temperature and pH for maximum activity of the enzyme were 60°C and 2.50, respectively. Km and Vmax values for sodium phytate of the enzyme were calculated to be 267 μM and 109.89 U/mL, respectively. The phytase exhibited broad substrate specificity. The phytase activity was stimulated by Ba2+and Li+ cations inhibited by Fe2+, Al3+ ve Pb2+cations. The enzyme activity was inhibited in the presence of NBS, PMSF, DTNB and 2,3-bütandion while CMC, DTT, ve β- merkaptoetanol were actvited. This results shows that tryptophan, cysteine, arginine and serine residues play an important role in the catalytic process. Sorbitol enchances thermostability of phytase. The enzyme was detemined to be highly againist organic solvents.