Theileria annulata sitokrom b geninde mutasyonların belirlenerek buparvaquone direnciyle ilişkisinin araştırılması ve Aydın çevresindeki enfekte sığırlarda direncin yaygınlığının saptanması

Abstract

Tropikal theileriosis, Theileria annulata'nın neden olduğu, yüksek morbidite ve mortaliteye bağlı olarak büyük ekonomik kayıplara neden olan protozoer bir hastalıktır. Günümüzde sahada tropikal theileriosis sağaltımında kullanılan tek etkili ilaç buparvaquone'dur. Ancak, son yıllarda tropikal theileriosisin başarısız tedavi olgularının sayısında bir artış gözlenmiştir. Bu durum, buparvaquon'a karşı direnç gelişmiş olabileceğini düşündürmektedir. Theileria annulata'nın buparvaquone'a karşı direnç gelişmiş olabileceği hipotezi doğrultusunda bu tezde, Theileria annulata sitokrom b geninde mutasyonların belirlenerek buparvaquone direnciyle ilişkisinin araştırılması ve Aydın ve çevresindeki enfekte sığırlarda direncin yaygınlığının saptanması amaçlanmıştır. Bu amaçla; kolorimetrik bir yöntem olan MTT testi ile akut theileriosisili vakalardan tedavi öncesi ve sonrası elde edilen izolatların replikasyon dereceleri ve metabolik aktiviteleri karşılaştırılmış ve ilaç baskısı altında izolatlar, gösterdikleri direnç açısından kıyaslanarak fenotipik olarak dirençli ve duyarlı olanlar belirlenmiştir. Duyarlı ve dirençli olarak belirlenen izolatlar satellit belirteçler kullanılarak ve T. annulata sitokrom b geni sekans analizleri yapılarak genotipik açıdan değerlendirilmiştir. Elde edilen bulgulara göre altı sinonim ve altı non sinonim mutasyon saptanmış olup, non sinonim mutasyonlardan ikisinin buparvaquone'un sitokrom b geni üzerindeki muhtemel bağlanma bölgelerinde olduğu tespit edilmiştir. Bu mutasyonların sitokrom b geni amino asit diziliminde 135. kodondaki Valin'in Alanin olarak (V135A) ve 253. kodondaki Prolin'in Serin olarak (P253S) değişimine neden olduğu tespit edilmiştir. Mutasyonların saptandığı hücre kültürleri klonlanarak MTT yöntemi ile test edilmiş ve elde edilen sonuçlar her iki mutasyonun da buparvaquone direnciyle ilişkili olabileceğini göstermiştir. Bu mutasyonların sahadaki yaygınlığının test edilebilmesi amacıyla allel-spesifik PCR metodu kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre V135A mutasyonu toplam 168 T. annulata pozitif kan örneğinden 10 adedinde ve 127 hücre kültüründen ikisinde saptanırken, P253S mutasyonu 168 T. annulata pozitif kan örneğinden bir adedinde ve 127 hücre kültüründen sekiz örnekte saptanmıştır. Bu bulgular bu iki mutasyonun T. annulata'nın buparvaquone karşı geliştirdiği dirençte etkili olabileceğini göstermiştir.

Tropical theileriosis is a protozoal disease caused by Theileria annulata leading to serious economic losses due to high morbidity and mortality. Buparvaquone is the only drug currently used to treat cases of tropical theileriosis in the field. However, an increase in the rate of treatment failure cases of tropical theileriosis has been observed in recent years, raising the possibility of resistance developed against buparvaquone. according to this hypothesis, the present study aim to investigate the mutations in Theileria annulata cytochrome b gene in association with buparvaquone resistance and the detection of prevalence of buparvaquone resistance in infected cattle in Aydın region. To this end, susceptibility to buparvaquone was examined by comparing the proliferative index of infected cells, which were obtained from cattle with theileriosis before and/or after treatment, under titration of buparvaquone dose using the MTT assay. Cell lines identified as resistant or susceptible were then genotyped using satellite markers and the DNA sequence of the T. annulata cytochrome b gene determined. The results identified six nonsynonymous and six synonymous mutations. Two out of six nonsynonymous mutations were found to be located at putative buparvaquone binding regions of cytochrome b. These mutations result in amino acid substitutions from valine 135 to alanine or proline 253 to serine. Isolates possessing an identified mutation were cloned and tested with the MTT assay which INDICATED that the clones with either of the two mutations located in the binding regions are resistant to buparvaquone. To test for the frequency of these mutations in the field, an allele specific PCR was developed. The results demonstrated that the mutation V135A in 10 out of 168 T. annulata positive blood samples and two out of 127 T. annulata macroschizont infected cell lines, while the P253S mutation was detected in one out of 168 T. annulata positive blood samples and eight out of 127 cell lines. These data suggest that the two point mutations are candidates for generation of genetic resistance of T. annulata against buparvaquone.