Trichomonas vaginalis ve Cryptosporidium parvum PARAZİTLERİNDE BULUNAN SİSTEİN PROTEAZ GENLERİNİN KLONLANMASI VE REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ

Abstract

Protozoa âleminin Apicomplexa filumunda yer alan Cryptosporidium türleri ökaryotik protozoonlardır ve tüm türleri hücre içi parazitlerdir. Cryptosporidiosis, Cryptosporidium cinsine bağlı, protozoonların neden olduğu, tüm dünyada oldukça yaygın olarak bulunan ve 100’den fazla canlı türünde görülen zoonoz bir hastalıktır. Flagellalı bir protozoon olan Trichomonas vaginalis, insanlarda üreme yolu enfeksiyonu olan trikomoniyaza neden olur.Trikomoniyaz dünyada viral olmayan cinsel yolla bulaşan en yaygın hastalıktır. T. vaginalis,idrar yolu, vajina ve prostata bulaşan, flagellalı, tek hücreli, anaerobik bir protozoondur.Sistein proteazlar hem Cryptosporidium hem de Trichomonas suşlarında önemli virulans faktörleri arasındadır. Birçok parazitte bulunan ve invazyonda önemli olan bu enzimler ilaç tasarımları için hedef olarak kabul edilirler. Bu çalışmada patojen olan Cryptosporidium parvum ve Trichomonas vaginalis türlerinin sistein proteaz genlerinin klonlanması amaçlanmıştır. Klonlamada kullanılmak amacıyla gen pozitif örnek bulmak için 63 Cryptosporidium spp ve 28 T. vaginalis örneği çalışılmış ve cryptopain için, 22(%35) ve CP39 içinse 19(%68) pozitiflik bulunmuştur. Tüm cryptopain pozitif suşların aynı zamanda cryptostatin için de pozitif olduğu saptanmıştır. Cryptopain, cryptostatin ve CP39 için pozitif saptanan örneklerden, restriksiyon enzim tanıma bölgeleri eklenerek oluşturulan primerler yardımıyla PCR yöntemiyle çoğaltılmıştır. Amplikonlar pET28a ekspresyon plazmidine yerleştirilmiş ve E.coli BL21 suşuna transformasyon yoluyla aktarılmıştır. Klonlanan cryptostatin, cryptopain ve cp39 genlerinden protein sentezlenip sentezlenmediği SDSPage yöntemiyle test edilmiştir. Transformantların sistein proteaz aktivitesinin belirlenmesi için jelatini parçalama özelliği test edilmiş sonuçta hem cryptopain hem de CP39 genleri aktarılmış E.coli BL21 suşlarının jelatinaz aktivitesi gösterdiği saptanmıştır. Cryptostatinin bu aktiviteyi önleme etkisi test edilmiş ve jelatinaz aktivitesinin önlendiği belirlenmiştir. Rekombinant olarak üretilen sistein proteazların tanıda ve tedavide kullanım potansiyeli vardır. Bu proteinlerin antijen olarak kullanılmasıyla elde edilecek antikorların tanı kitlerinde kullanım olasılığı mevcuttur. Bu proteazların hasarlı dokuda debridman olarak kullanılabileceği öngörülmektedir. Ayrıca sistein proteazların başka parazitlerde aşı antijeni olarak kullanımı üzerine çalışmalar mevcuttur. Proteaz inhibitörlerinin ise parazit enfeksiyonlarının tedavisinde ilaç olarak kullanılma olasılığı vardır.