Kainik asit ile hücrelerde eksitotoksisite modelinin oluşturulması ve Glutamat Taşıyıcısı-1 (GLT-1)'in incelenmesi.

Abstract

Eksitotoksisite, MSS’ nin moleküler işleyişinde sinaptik boşluğa salınan glutamatın, anormal ve aşırı artışı olarak tanımlanan bir durumdur. Çoğunlukla glutamatı sinaptik boşluktan temizleyecek glutamat taşıyıcılarının, glutamatın taşınımını gerçekleştirememesi sonucu gerçekleşir ve hücre ölümüyle sonuçlanır. Kainik asit, glutamat reseptör agonisti olarak bilinen güçlü bir nörotoksindir ve nöronal hasar oluşumu ve gelişimini tetikleyerek eksitotoksisiteye neden olur. MSS normal işleyişinde, presinaptik nöronlardan sinaptik boşluğa salınan glutamatın, astrositlerin ve postsinaptik nöronların membranlarında bulunan glutamat taşıyıcıları tarafından hücrelere alımı ve sinaptik boşluktan temizlenmesi gerçekleştirilmektedir. En fazla glutamat taşınımı GLT-1 ile sağlanmaktadır. Bu çalışmada; nöroblastoma ve glia hücrelerinde, kainik asit ile eksitotoksisitenin indüklenmesi sonucu GLT-1’in ifadesinde meydana gelen değişiklikler ve bu taşıyıcıların normal süreçteki glutamat taşınımında önemi gösterilmek istenmiştir. MTT Assay Testi ile 50, 200, 500, 1000 µM dozlarda kainik asit, N2A ve IHA hücrelerine verilerek 24 saat sonunda hangi dozda eksitotoksisite durumu ile hücre ölümü gerçekleştiği belirlenmiş, belirlenen dozda petrilerde kültüre edilen hücrelere kainik asit verilmiştir. 24 saat inkübasyon sonrası kontrol ve kainik asit verilen hücrelerden protein ekstraktları elde edilmiş ve protein miktar tayini gerçekleştirilmiştir. Western Blot tekniği kullanılarak GLT-1 taşıyıcısının protein düzeyindeki ifadesine bakılmıştır. Protein ifadesi belirlenemeyen hücrelerden RNA izolasyonu gerçekleştirilmiş, cDNA üretilmiş ve RT-PCR tekniği kullanılarak GLT-1’in mRNA düzeyindeki ifadesi kontrol ve kainik asit verilen örnekler arasında karşılaştırılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda, kullanılan N2A hücre hattı için kainik asit ile indüklenen GLT-1 protein ifadesi Western Blot tekniği ile görüntülenemedi. Bu nedenle, kontrol ve kainik asit verilen N2A hücrelerinden RNA elde edilerek GLT-1’in mRNA düzeyi araştırıldı. GLT-1’in mRNA düzeyindeki ifadesinin, kainik asit verilmiş hücrelerde kontrole oranla arttığı gözlemlendi. Bununla birlikte, glia hücrelerinde yapılan çalışmalarda ise kainik asit verilen hücrelerin GLT-1 protein seviyesinin kontrol hücrelerine göre arttığı gözlemlendi. Her iki hücre türünde alınan sonuçlar birbiri ile uyumlu olup eksitotoksisite durumunda, sinaptik boşlukta fazla bulunan glutamatı toplamak için GLT-1 seviyesinde beklenen artışın görüldüğü bulundu.