Bu çalışmada endemik bir bitki olan Centaurea zeybekii Wagenitz'nin in vitro
çimlenmesi ve mikroçoğaltımı üzerine araştırmalar yapılmıştır. Türün
kapitulumlarından çıkarılan tohumlar (aken meyve) denemelerde başlangıç materyali
olarak kullanılmıştır. Çalışma iki aşamada planlanmıştır. Birinci aşamada, farklı in
vitro çimlendirme ortamlarının, gibberellik asitin, ışığın ve sıcaklığın çimlenme
üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu denemelerde Centaurea zeybekii tohumlarının
optimum in vitro çimlenme koşullarının belirlenmesi ve çimlenen fideciklerin dış
ortamlara aktarılarak populasyonun ex situ elde edilmiş bireyler kullanılarak
güçlendirilmesi hedeflenmiştir. kinci aşamada ise, in vitro koşullarda çimlenen
tohumlardan steril fide gelişimi için uygun ortamların belirlenmesinin yanı sıra, bu
fidelerin çeşitli kısımlarının eksplant olarak kullanılması ile aksiller ve adventif
sürgün oluşumu teşvik edilmeye çalışılmıştır.
Kapitulumlardan çıkarılan tohumlara öncelikle canlılık testi yapılmış ve canlılık
yüzde olarak belirlenmiştir. Temmuz ve Ağustos aylarında toplanan tohumlara
uygulanan tetrazolium testinin sonuçlarına göre, Temmuz ayında toplanan
tohumların çok az bir kısmının boyandıkları (%30) ve bu boyanmanın da çok açık
renkte olduğu gözlenmiştir. Ağustos ayında toplanan tohumların ise % 98'inin
boyandıkları ve çok net olarak kırmızı renk aldıkları görülmüştür. TTC testi
sonuçlarına göre Ağustos ayında toplanan tohumların hemen hepsinin canlı oldukları
ve uzun bir süre (20şC sıcaklık, %50-60 nemde) canlılıklarını korudukları
belirlenmiştir.
lk denemede, GA3 destekli ve desteksiz değişik in vitro ortamlar kullanılmış, C.
zeybekii türünün in vitro çimlenmesi için en uygun ortam araştırılmıştır. Tohumlar
akan çeşme suyu altında yarım saat yıkandıktan sonra, 10 dakika boyunca % 70'lik
etil alkolde, ardından 15 dakika % 4.5'luk sodyum hipoklorit solusyonunda tutulup
sterilizasyonları sağlandıktan sonra üç defa distile su ile yıkanmıştır. Steril edilen
tohumlar farklı konsantrasyonlarda (1, 2 ve 3 mg/L) gibberellik asit içeren ve
içermeyen çimlendirme ortamlarına (Sıvı MS, White, B5, vitamin destekli distile su)
alınarak, 24±2 şC'de 16/8 saat fotoperiyot koşulları altında kültüre edilmişlerdir. Bu
denemenin sonunda en yüksek çimlenme yüzdesinin vitamin destekli distile suya 1
mg/L GA3 ilavesi ile hazırlanmış ortamda olduğu görülürken (% 80), bunu sırasıyla 2
mg/L GA3 ilaveli White (%45) ve B5 (%45) ortamları izlemiştir. Denemenin bundan
sonraki aşamalarında maksimum çimlenmenin elde edildiği 1 mg/L GA3 ilaveli
distile su ortamı temel ortam olarak kullanılmıştır.
kinci denemede çimlenme üzerine ışığın etkisi araştırılmıştır. 1 mg/L GA3 ilaveli
distile su ortamlarına ekilen bir grup tohum 16/8 saat fotoperiyoda tabi tutulurken,
diğer bir grup karanlıkta 24 ±2 şC'de inkübasyona bırakılmıştır. Denemenin sonunda
C. zeybekii tohumları karanlık koşullarda %80 çimlenme gösterirken, aydınlıkta bu
oran %78 olarak belirlenmiş ve çimlenme yüzdeleri karşılaştırıldığında ışık ve
karanlık uygulamaları arasında önemli bir farklılık bulunmamıştır.
Üçüncü denemede tohum çimlenmesi üzerine sıcaklığın etkisi araştırılmıştır.
Sterilize edilmiş tohumlar 1 mg/L GA3 ilaveli distile su ortamlarına aktarıldıktan
sonra 15, 20, 25, 30 ve 35 şC'lik sıcaklıklarda kültüre edilmişlerdir. 24±2 şC'de
inkube edilen tohumlar en yüksek çimlenme yüzdesine sahipken (% 79), bu değerin
altında ve üstündeki sıcaklıklarda çimlenme yüzdesinin düştüğü görülmüştür.
In vitro koşullarda çimlendirilen (kotiledonları belirmiş) tohumların bir kısmı
bahçe toprağı içeren saksılara alınmış ve iklim odası koşullarında yaklaşık 8 ay
boyunca yaşatılabilmişlerdir. Çimlenen tohumların diğer bir kısmı ise en uygun
gelişim gösterecekleri in vitro ortamın belirlenmesi amacı ile B5, MS ve White
ortamlarına aktarılmışlardır. Yaklaşık 8 hafta sonra (dört haftada bir alt kültür
edilmiştir) fideciklerin gelişimleri (sürgün boyu, sürgün sayısı, yaprak sayısı, yaprak
genişliği, kök boyu, kök sayısı) incelenerek sonuçlar değerlendirilmiştir.
Denemelerimizde White ortamına aktarılan fidelerin hemen hepsinin bir ay sonra
öldükleri gözlenmiştir. B5 ve MS ortamlarındaki fideler yaklaşık 8 hafta sonra
morfolojik kriterler açısından incelendiğinde fide gelişimi için en uygun ortamın MS
olduğu sonucuna varılmıştır.
Bitki gelişimi için en uygun ortam olarak belirlenen MS ortamında gelişen
yaklaşık 4 haftalık steril fideler aksiller sürgün çoğaltımı için, primer köklerinden
ayrılarak farklı sitokinin tip ve konsantrasyonlarını (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L BA, 0.2,
0.5, 1 ve 2 mg/L KIN ve 0.001, 0.005, 001 ve 0.02 mg/L TDZ) içeren MS temel
besi ortamlarına aktarılmışlar ve 24±2 şC'de 16/8 saat fotoperiyot koşullarının
sağlandığı kültür odasına alınmışlardır. 4 haftalık süre sonunda artan sürgün sayıları
belirlenerek aksillar sürgün çoğaltımı için en uygun sitokinin tip ve konsantrasyonu,
sürgün sayısı ve sürgün boyu açısından değerlendirilmiştir. TDZ içeren ortamlara
aktarılan fidelerde aksiller sürgün çoğaltımı teşvik edilmesine rağmen, sürgünlerin
kısa boylu kümeler halinde belirdiği ve hemen hepsinin hiperhidrik oldukları
görülmüştür. En yüksek çoğalma oranı eksplant başına 14.85 (sürgün/eksplant)
sürgün sayısı ile 1 mg/L BA ilaveli MS ortamında elde edilmiştir. Maksimum sürgün
boyunun en yüksek ortalaması ise bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen ve 2 mg/L
KIN içeren MS ortamlarında elde edilmiştir. KIN ve BA içeren ortamlarda artan
sürgün boyuna karşılık, sürgün sayısında bir azalma yani konsantrasyona bağlı olarak
sürgün sayısı artışı ile sürgün boyu arasında negatif bir ilişki olduğu gözlenmiştir.
Direkt adventif sürgün rejenerasyonu denemelerinde in vitro koşullarda
çimlendirilmiş steril fidelerin yaprakları eksplant olarak kullanılmıştır. ki aylık steril
fidelerin yaprakları aksiller tomurcukları olmaksızın abaksial yüzleri ortamla temas
edecek şekilde BA (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L), KIN (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L) ve TDZ
(0.001, 0.005, 0.01ve 0.02 mg/L) içeren ve içermeyen MS ortamlarında kültüre
edilmişlerdir. TDZ ilaveli ortamlarda yüksek oranda kalluslaşma görülmüştür.
Kalluslaşma oranları 0.001 mg/ L TDZ'de % 90, 0.005 mg/ L ve 0.01 mg/L TDZ'de
% 100'ü bulurken, bu oran 0.02 mg/L TDZ'de %47.5' e düşmüştür. BA ilaveli
ortamlarda ise kalluslaşma oranları; 0.5 mg/L BA'da %52.5, 1mg/L BA'da %27.5 ve
2 mg/L BA' da ise %35 oranındadır. 0.2 mg/L BA ilaveli ortamlarda kalluslaşma
oranı düşük (% 5) olmasına rağmen, organogenik cevabın nodüler kallus halinde
belirmesi ve alt kültürlemeler ile bu durumun değişmemesi nedeniyle bu sitokinin
tipi de direk adventif sürgün rejenerasyonu için etkisiz bulunmuştur. KIN ilaveli
ortamlarda ise düşük oranlarda kalluslaşma görülmüştür. Kalluslaşma oranları 0.2
mg/L KIN'de % 5, 0.5 mg/L KIN'de % 2.5, 1 mg/L KIN'de % 4 iken, 2 mg/L KIN
içeren ortamda kalluslaşma görülmemiştir. Denenen tüm konsantrasyonlarda
yaklaşık iki hafta sonra yaprakların yüzeylerinde orta damara yakın yerlerde
sürgünler belirmeye başlamış (küçük yaprak çıkışı) ve iyi gelişmiş sürgünler 6.
haftanın sonunda gözlenmiştir. Direkt sürgün rejenerasyonu gözlenen ortamlarda
eksplantların ortamla temas ettiği kısımlarında kalluslaşma görülmüş ancak bu
kalluslar zamanla karararak etkinlik göstermemişlerdir. Eksplant başına en yüksek
sürgün sayısı 1 mg/L KIN içeren ortamda (6.2 sürgün/eksplant) elde edilmiştir.
Maksimum sürgün boyunun en yüksek ortalaması da (4.17 cm) yine bu ortamda
gözlenmiştir. Sonuç olarak C. zeybekii türünün in vitro elde edilmiş steril fide
yapraklarının eksplant olarak kullanılması ile direkt adventif sürgün rejenerasyonu
için 1 mg/L KIN ilaveli MS ortamının eksplant başına en yüksek sürgün sayısı ve
maksimum sürgün boyu açısından en iyi ortam olduğunu söylemek mümkündür.
Aksiller ve adventif sürgün oluşumu denemelerinden elde edilen sürgünler stok
kültürden ayrılarak köklenmeleri için 0.5, 1, 2 ve 5 mg/L IAA, IBA, NAA içeren MS
ve ½ MS ortamlarına alınmıştır. MS ve ½ MS ortamları arasında köklenme teşviki
açısından belirgin bir farklılık görülmemiştir. Ancak köklenme son derece düşüktür
ve sürgünlerin sadece %15'i 0.5 mg/L IBA ilaveli ortamlarda köklendirilebilmiştir.
Köklenen bitkicikler dış ortamlara kademeli bir şekilde aktarılarak aklimatize
edilmiştir.
In this study, in vitro germination and micropropagation of Centaurea zeybekii
had been investigated. Achenes from the capitula were used as initial explants in the
experiments. The experiments were divided into two steps. At the first, effects of
different in vitro media with gibberellic acid, illumination, temperature on
germination were investigated. In these experiments, determination of optimum in
vitro germination conditions for seeds of C. zeybekii and reinforcement of natural
population with a support from seedlings acclimated to natural conditions have been
aimed. At the second step, determination of appropriate medium for sterile seedlings
from in vitro germinated seeds and induction of axillary and adventitous shoot
formation by using some parts of these seedlings have been strived out.
Viability tests were applicated to the seeds and results were shown as % of total
number. According to tetrasolium test results of seeds which were collected in July
and August, seeds of July were less (pale red) tinged (some parts were not tinged)
and the percentage was 30 %. The seeds of August were almost completely tinged
(red) and the percentage was 98 %. According to TTC tests, seeds collected in
August were almost completely alive (survive long time under 20ºC temperature 50-
60 % humidity conditions)
In the first experiment, two different in vitro media (with GA3 and not) were used
to describe the most proper medium for the germination. Achenes were sterilized by
using a procedure of 70 % ethanol for 10 min. 4,5 % hypochlorite for 15 min. and
then they were washed three times with distilled water after the first washing under
tap water for 30 minutes. Sterilized seeds were cultured under 24±2 ºC 16/8 h
photoperiod conditions by transferring them to germination media (liquid MS, B5,
vitamine supported distilled water) containing gibberellic acid in different
concentrations and without gibberellic acid. At the result of this experiment, the
highest germination rate (80 %) was in distilled water containing 1 mg/L GA3 and
followed by White (45 %) containing 2 mg/L GA3 and B5 (45 %). In the later steps
of the experiment, distilled water containing 1 mg/L GA3 presented the maximum
germination rate was used as main medium.
In the second experiment, effect of illumination on germination was investigated.
A group of seeds cultured in media containing 1 mg/L GA3 was exposed to 16/8 h
photoperiod while the another group was kept in dark under 24±2 ºC condition.
Finally, germination rate of C. zeybekii seeds was 80 % under dark condition and it
was 78 % under photoperiod condition showing no important difference between the
groups.
At the third experiment, effect of temperature on germination was investigated. It
was found that the highest germination rate was held (79 %) in seeds incubated under
24±2 ºC and germination rate was decreased below and above this temperature.
Some of in vitro germinated seeds were transferred to pots and they survived 8
months under growth chamber conditions. Remaining germinated seeds were
transferred to B5, MS and White media to determine the in vitro medium for
optimum development. Approximately 8 weeks later (subculturing in 4 weeks
interval), development of seedlings (shoot length, shoot number, leaf number, leaf
width, root length, root number) were evaluated. All of the seedlings which were
transferred to White medium died one month later. MS was selected as the most
proper medium for seedling development depending on a comparison with B5
medium using morphological criteria after 8 weeks.
4 weeks old seedlings, that were developed on MS media which was determined
as the optimum media for seedling development, were separated from primary roots
and transferred to MS basal media with different types of cytokinin and
concentrations (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L BA, 0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L KIN and 0.001,
0.005, 001 and 0.02 mg/L TDZ) for axillary propagation. At the end of 4 week-
period, increase in shoot number and shoot length were determined and optimum
cytokinin type and concentration for axillary shoot propagation were determined.
Inspite of induction of axillary shoot regeneration in seedlings growing in TDZ
media, the seedlindgs were developed in short groups having hyperhydricity (nearly
in all). The highest propagation rate was obtained in the medium containing 1 mg/L
BA with 14.85 shoot per explant. The highest average of the maximum shoot length
was obtained in MS media without plant growth regulators but containing 2 mgl
KIN. There were decrease in shoot number which is negatively correlated with
increase in shoot length in MS media containing KIN and BA.
Leaves of in vitro germinated steril seedlings were used as explants in direct
adventitous shoot regeneration experiments. Leaves of sterile seedlings (two months
old) without axillary buds were cultured in the media with or without BA (0.2, 0.5, 1
and 2 mg/L), KIN (0.2, 0.5, 1 and 2 mg/L) and TDZ (0.001, 0.005, 0.01 and 0.02
mg/L) as their abaxial sides down and contact with the medium.. The highest callus
formation rate was observed in the media containin TDZ. Although callus formation
rates were 90 % in 0.001 mg/ L TDZ, 100 % in 0.005 mg/ L and 0.01 mg/L TDZ , it
was decreased as 48 % in 0.02 mg/L TDZ. In BA containing media, callus formation
rates were 52,5 % in 0.5 mg/L, 27,5 % in 1mg/L BA and 35 % in 2 mg/L BA.
Although the low percentage of callus formation in 0.2 mg/L BA added medium (5
%), this cytokinin type is found non-efficient for direct adventitious shoot
proliferation as organogenic answer appears with only shoot buds and this case
continues in the subcultures. Callus formation was also observed in media
containing KIN. Callus formation rates were %5 in 0.2 mg/L KIN, 2,5 % in 0.5 mg/L
KIN, 4 % in 1 mg/L KIN and no callus formation was observed in the medium
containing 2 mg/L KIN. In all concentrations, initiations of shoots (small leaf
initiations) close to midrib and well developed shoots were observed at the end of
sixth week. In the media having direct shoot regeneration, calli formation in explants
on their surfaces having contact with the medium were observed but these calli
became brownish in time and showed no activity. The highest number of shoots per
explant (6,2 shoot per explant) was obtained from the medium containing 1 mgl KIN.
The highest average of maximum shoot length was also observed in this medium.
Finally, it is possible to stress that medium containing 1 mgl KIN is the best medium
by obtaining maximum shoot length and highest number of shoots per explant for
direct adventitous shoot regeneration with explants from in vitro germinated shoot
leaves.
The shoots from axillary and adventitous shoot formation experiments were
transferred to MS and ½ MS media containing 0.5, 1, 2 and 5 mg/L IAA, IBA, NAA
for rooting. There was no difference between MS and ½ MS media in rooting but it
was very low and only 15 % of total shoots could rooted in medium containing 0.5
mg/L IBA. Rooted plantlets were gradually acclimated to the natural conditions.
