PPM1/DWip1 (Protein phosphatase 1D magnesium dependent/wild type p53 induced
phosphatase) genotoksik stres üzerine DNA hasarıyla p53’e bağlı olarak indüklenen bir
serin/treonin fosfatazdır. Ancak Wip1 fosfataz stres ve doku tipine bağlı olarak E2F, CREB,
c-Jun ve NF-κB gibi diğer transkripsiyon faktörleriyle de indüklenebilir. Wip1 fosfataz
indüklendiğinde p53, Chk1, Chk2, H2AX, ATM/ATR dahil çok sayıda proteini
defosforilasyon yoluyla inaktive ederek stres cevaplarını azaltmakta ve sonuç olarak hücre
döngüsü kontrol noktaları, senesens ve apoptoziside engellemektedir. Wip1’in özellikle wtp53’
e sahip insan solid tümörlerinde aşırı ifade edildiği, amplifiye olduğu ve mutasyona
uğradığı ve böylece bir onkogen gibi davrandığı bilinmektedir. Wip1’in deregülasyonu solid
tümörlerde kötü prognozla da ilişkililendirilmiştir. Ancak hematolojk kanserlerde ve
özellikle mt-p53’e sahip olan akut lösemilerde Wip1’in aşırı ifade edildiğinde rolünü ve
sonuçlarını gösteren kapsamlı bir çalışma henüz bulunmamaktadır. Bu nedenle bu çalışma
da Wip1’i aşırı ifade eden ve mt-p53’ e sahip olan akut T lenfoblastik lösemi hücre dizisi
(Jurkat) kullanılarak Wip1’ın kemoterapi indüklü hücresel stres cevapları üzerine rolü
araştırılmıştır.
Öncelikle Jurkat hücrelerinde Wip1 fosfatazın aşırı ekspresse olduğu qRT-PCR ve Western
blot analizleriyle konfirm edilmiştir. Wst-1 testi ile etoposid ve doxorubicinin metabolik
aktivite üzerinde etkilerinin zamana ve doza bağlı olduğu tespit edilmiştir. Jurkat
hücrelerinin etoposid ve doxorubicinle 24 saatlik muamelesi sonucunda apoptozise direnç
gösterirken 72 saatlik muamele sonucunda apoptozis oranının arttığı Annexin V ve
Caspase3/7 aktivasyon testleri ile belirlenmiştir. Benzer şekilde Jurkat hücrelerinin etoposid
ve doxorubicinle 72 saatlik inkübasyon sonucunda senesens oranının da oldukça düşük
olduğu tesbit edilmiştir. Sonrasında Jurkat hücrelerinde etoposid ve doxorubicine cevaben
DNA hasarı cevabının önemli elemanlarının ATM, ATR, Chk1, Chk2 ve H2AX dahil
fosforilasyon düzeyleri WB analiziyle test edildiğinde özellikle ATM ve ATR’nin
fosforilasyon düzeylerinin çok düşük olduğu tesbit edilmiştir. Takiben Jurkat hücrelerinde
xvi
RNA interferansı yöntemiyle Wip1 hedeflendiğinde ise etoposid ve doxorubicine cevaben
DDR elemanlarının hepsinin ATM, ATR, Chk1, Chk2 ve H2AX dahil fosforilasyon
düzeylerinin arttığı görülmüştür. Wip1’in Jurkat hücrelerinde RNA interferansı ile
hedeflenmesi sürpriz bir şekilde AnnexinV ve Caspase 3/7 testi ile gösterildiği gibi
apoptozis oranını azaltırken SA-β-gal testiyle gösteridiği gibi senesens oranını artırmıştır.
Ayrıca Jurkat hücrelerinde Wip1’in knock-down edilmesinin hücre döngüsü tutuklanması
üzerinde etkili olmadığı görülmüştür.
Wild-type p53-induced phosphatase 1 (Wip1/PPM1D), is a serin/threonine phosphatase
induced upon genotoxic stress by DNA damage in a p53-dependent manner. However
depending on the type of stress or tissue Wip1 phosphatase can be also induced by other transcription factors such as E2F, CREB, c-Jun and NF-κB. Upon induction, Wip1 dampens the stress responses by inactivating multiple proteins via dephosphorylation including p53, Chk1, CHK2, H2AX, ATM/ATR consequently abrogates cell cycle checkpoints and inhibits senescence and apoptosis. Wip1/PPM1D is known to be overexpressed, amplified and mutated in human solid tumors hence displaying typical oncogenic properties. Deregulation of Wip-1 is also associated with poor prognosis in various types of human solid tumors. However, in hematological cancers, especially in acute leukemia containing mt p53, so far no data has shown the role of overexpression of Wip1 phosphatase and it’s consequences. Hence, in this study Wip1 overexpressing acute T lymphoblastic leukemia cell line (Jurkat) containing mt p53 was used to investigate the role of Wip1 phosphatase on chemotherapy induced cellular stress responses.
Firstly, overexpression of Wip1 was confirmed with q-RT-PCR and Western blot analyses
in Jurkat cells. Metabolik activity of Jurkat cells in response to etoposid and doxorubicin
was determined by Wst-1 test in a time and dose dependent manner. When analysed for
apoptosis in response to doxorubicin and etoposide treatment by Annexin V and Caspase3/7 tests for 24 h Jurkat cells showed resistance to apoptosis whereas they were responsive after 72 h treatment. Similarly when Jurkat cells were tested for induction of senescence in response to etoposide and doxorubicin treatment the amount of senescencent cells were also little. As next, when Jurkat cells were analysed for phosphorylation status of the key lements of DNA damage response (DDR) ATM, ATR, Chk1 and Chk2 as well as H2AX, in response to etoposide and doxorubicin treatment by WB analysis, the results showed that xviii phosphorylation levels of the DDR elements especially ATM and ATR were significantly low. Accordingly targeting Wip1 levels by RNA interference were increased the phosphorylation status of all DDR elements including ATM, ATR, Chk1, Chk2 and H2AX levels in Jurkat cells. Surprisingly, targeting Wip1 by RNA interference decreased the levels of apopotosis in Jurkat cells whereas it was increased the senescence levels as determined by AnnexinV and Caspase 3/7 and SA-β-gal tests, respectively. In addition knock down of Wip1 was not effective on cell cycle arrest in Jurkat cells.
