Mastitisli sığır sütlerinden izole edilen candida türlerinin moleküler tanısı

DSpace Ana Sayfası
→
Tez
→
Doktora
→
Öğe Göster

dc.contributor.advisor	Türkyılmaz, Süheyla
dc.contributor.author	Cilvez, Perihan
dc.date.accessioned	2017-12-19T10:23:48Z
dc.date.available	2017-12-19T10:23:48Z
dc.date.issued	2017-12-19
dc.date.submitted	2017-11-22
dc.identifier.other	VTF- 15001
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11607/3247
dc.description	Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından VTF- 15001 proje numarası ile desteklenmiştir	tr_TR
dc.description.abstract	Sığır mastitisi, süt endüstrisinin ekonomik açıdan önemli ve Candida cinsine ait mayaların etiyolojik etkenler olarak katılabileceği en yaygın hastalıklardan birisi olarak bilinmektedir. Bu çalışmada, subklinik mastitisli sığır sütlerinden Candida türlerinin izolasyonu, izolatların geleneksel yöntem, kromojenik agar ve sekans analizi kullanılarak identifikasyonlarının yapılması amaçlandı. Çalışmanın materyalini 20 süt sığırcılığı işletmesindeki 280 subklinik mastitisli ineğe ait 400 süt örneği oluşturdu. Süt örneklerinden %24,0 (96/400) oranında Candida spp. izole edildi. Geleneksel yöntem ile izolatların %16,7 (16/96)’si Candida albicans olarak identifiye edilirken %83,3 (80/96)’ü non-albicans olarak belirlendi. Kromojenik agar kullanılarak izolatların %49,0 (47/96) [%21,9’u (21/96) Candida krusei, %17,7 (17/96)’si C. albicans, %9,4 (9/96)’ü Candida tropicalis)]’nun identifikasyonu yapılırken; izolatların %51,0 (49/96)’inin identifikasyonu yapılamadı. Sekans analizi sonucunda ise izolatların %22,9 (22/96)’unun Candida parapisilosis, %21,9 (21/96)’unun C. krusei, %19,8 (19/96)’inin Candida keyfr, %16,7 (16/96)’sinin C. albicans, %9,4 (9/96)’ünün C. tropicalis, %4.2 (4/96)’sinin Candida glabrata, %3,1 (3/96)’inin Candida guilliermondii, %1,0 (1/96)’inin Candida lipolytica, %1,0 (1/96)’inin Trichosporon asahii olduğu tespit edildi. Bu çalışmada subklinik mastitisin etiyolojisinde çok farklı Candida türlerinin rol oynayabileceği; ancak, bu bölgede enfeksiyona neden olan ana maya türlerinin non-albicans Candida türler belirlendi. Candida izolatlarının identifikasyonlarında moleküler yöntemlere göre daha düşük maliyetli ve kolay uygulanabilir olan geleneksel yöntem ile C. albicans’ın; kromojenik agar ile C. krusei, C. tropicalis ve C. albicans türlerinin identifiye edilebildiği; diğer Candida türlerinin identifikasyonlarında moleküler yöntemler ile daha başarılı sonuçlar alındığı saptandı. İyi hijyen ve sağlık uygulamaları ile antibiyotiklerin dikkatli kullanılmasının sığır mikotik mastitis insidensini düşüreceği düşünülmektedir.	tr_TR
dc.description.abstract	Cattle mastitis is considered to be one of the most common diseases in which the dairy industry is economically important and yeasts belonging to the genus Candida may participate as etiological agents. In this study, isolation of Candida species from subclinical mastitic cattle milk, identification of isolates using conventional method, chromogenic agar and sequence analysis was aimed. The material of the study consisted of 400 milk samples belonging to 280 subclinical mastitis in 20 dairy cattle farms. Of the milk samples, 24.0% (96/400) of Candida spp. isolated. By conventional method, 16.7% (16/96) of the isolates were identified as Candida albicans and 83.3% (80/96) were identified as non-albicans. Using chromogenic agar, 49.0% (47/96) [ 21.9% (21/96) Candida krusei, 17.7% (17/96) C. albicans, 9.4% (9/96) Candida tropicalis)] of the isolates were identified; 51.0% (49/96) of the isolates could not be identified. Sequence analysis showed that 22.9% (22/96) of the isolates were Candida parapsilosis, 21.9% (21/96) were C. krusei, 19.8% (19/96) were Candida keyfr, 16.7% (16/96) were C. albicans, 9.4% (9/96) were C. tropicalis, 4.2% (4/96) Candida glabrata, 3.1% (3/96) of Candida guilliermondii, 1.0% (1/96) of Candida lipolytica, and 1.0% (1/96) of Trichosporon asahii. In this study, it was demonstrated that very different Candida species could play a role in the etiology of subclinical mastitis but the main yeast strains causing the infection in this region were found to be non-albicans Candida species. In identification of Candida isolates by the conventional method of C. albicans, by chromogenic agar C. krusei, C. tropicalis and C. albicans species can be identified which is less costly and easier to apply than molecular methods, it was determined that more successful results were obtained with molecular methods in the identification of other Candida species. Careful use of antibiotics with good hygiene and health practices is thought to reduce the incidence of bovine mycotic mastitis.
dc.description.sponsorship	ADÜ-BAP	tr_TR
dc.description.tableofcontents	İÇİNDEKİLER KABUL ONAY ………..………………………………………………………………… i TEŞEKKÜR………………………………………………..……………….……………. ii İÇİNDEKİLER………………………………………….………………………………... iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ………………..…………………………….. vii RESİMLER DİZİNİ………………………………………………………………………. ix TABLOLAR DİZİNİ…………………………………………………………….……….. x ÖZET…………………………………………………………………………...………… xi ABSTRACT……………………………………………………………………….……… xii 1. GİRİŞ …………..………………………………………………………………..……. 1 2. GENEL BİLGİLER………………………………………………………………….... 3 2.1. Tarihçe……….……………………………………………………………………… 6 2.2. Candida Türlerinin Sınıflandırılması ve Genel Özellikleri………………………….. 8 2.2.1. Tıbbi Önemi Olan Candida Türleri……………………………………………….. 12 2.2.1.1. Candida albicans……………………………………………………………….. 12 2.2.1.2. Candida tropicalis…………………………………………….………………… 14 2.2.1.3. Candida glabrata……………………………………………..………………… 14 2.2.1.4. Candida parapsilosis……………………………………………………………. 15 2.2.1.5. Candida lusitaniae………………………………………………………………. 15 2.2.1.6. Candida kefyr (Candida pseudotropicalis)…………………….……………….. 15 2.2.1.7. Candida guilliermondii……………………………………….…………………. 16 2.2.1.8. Candida krusei………………………………………………..………………….. 16 2.2.1.9. Candida utilis………………………………………………….…………………. 17 2.2.1.10. Candida xylopsoci………………………………………………………………. 17 2.2.1.11. Candida dubliniensis……………………………………………………………. 17 2.2.1.12. Candida stellatoidea………………………………………….………………… 18 2.2.1.13. Candida lipolytica (Yarrowia lipolytica) …………………..…………………... 18 2.2.1.14. Candida famata…………………………………………………………………. 18 2.2.1.15. Candida norvegensis……………………………………………………………. 19 2.2.1.16. Candida pelliculosa…………………………………………………………….. 19 2.2.2. Morfolojisi ve Boyanma Özellikleri…………………………………..…………… 19 2.2.3. Üreme ve Biyokimyasal Özellikleri……………………………………………… 20 2.3. Candida’ların Hücre Yapısı………………………………………………………… 23 2.3.1. Hücre İskeleti……………………………………………………………………… 23 2.3.2. Hücre Membranı…………………………………………………………………… 24 2.3.3. Hücre Sitoplazması………………………………………………………………… 24 2.3.4. Hücre Duvarı………………………………………………………….…………… 24 2.4. Candida’ların Virulans Faktörleri……………………………………………..……. 25 2.4.1. Adezyon…………………………………………………………………………… 26 2.4.2. Maya-Hif Dimorfizmi (Morfogenez)….……………………………….…………. 27 2.4.3. Fenotipik Değişim……………………………………………………..…………… 28 2.4.4. Biyofilm Oluşumu ve Slime Faktör………………………………………………... 29 2.4.5. Enzimler……………………………………………………………….…………… 31 2.4.5.1. Salgısal Aspartil Proteinazlar………………………………….………………… 31 2.4.5.2. Fosfolipazlar…………………………………………………..………………….. 32 2.4.5.3. Lipazlar……………………………………………………….………………….. 33 2.4.5.4. Esterazlar…………………………………………………………………………. 33 2.4.6. Siderofor Üretimi……………………………………………….………………….. 33 2.4.7. Toksik Moleküller………………………………………………………………….. 33 2.5. Epidemiyoloji………………………………………………………………….…….. 34 2.6. Patogenez…………………………………………………………………………….. 35 2.7. İmmunoloji………………………………………………………………………….... 36 2.8. Candida’ların Yol Açtığı Enfeksiyonlar……………………………………………... 37 2.9. Laboratuvar Tanı Yöntemleri………………………………………………………… 38 2.9.1. Bakteriyolojik Tanı Yöntemleri…………………………………………………… 39 2.9.1.1. Bakteriyoskopi…………………………………………………………………… 39 2.9.1.2. Kültür……………………………………………………………………………. 40 2.9.1.2.1. Boyama………………………………………………………………………… 40 2.9.1.2.2. Hif, Blastospor, Klamidospor Oluşumu………………………………………. 40 2.9.1.2.3. Germ Tüp……………………………………………..……………………….. 41 2.9.1.2.4. Kromojenik Besiyerleri………………………………………………………… 42 2.9.1.3. Biyokimyasal Testler………………………………………….…………………. 44 2.9.1.3.1. Karbonhidrat Fermentasyon ve Assimilasyon Testleri………………………… 44 2.9.1.3.2. Nitrat Testi…………………………………………………………………… 46 2.9.1.3.3. Hızlı Trehaloz Testi…………………………………..………………………… 46 2.9.1.3.4. Üreaz Testi……………………………………………………………………... 46 2.9.1.3.5. Tuz Toleransı Testi……………………………………………………………. 47 2.9.1.3.6. Isı Toleransı Testi……………………………………………………………… 47 2.9.2. Serolojik Tanı Yöntemleri………………………………………………………… 47 2.9.3. Moleküler Tanı Yöntemleri………………………………………………………… 48 2.9.3.1. PZR……………………………………………………………………………… 49 2.9.3.2. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)…………………… ………………… 52 2.9.3.3. DNA Dizi Analizi (Sekans)………………………………………… ………….. 53 3. GEREÇ VE YÖNTEM……………………………………………………………… 54 3.1. Gereç……….……………………………………………………………….……… 54 3.1.1. İzolasyon Örnekleri…………………………………………………..…………… 54 3.1.2. Besiyerleri………………………………………………………………………… 54 3.1.2.1. Sabouraud Dextrose Agar……………………………………………………… 54 3.1.2.2. Kromojenik Candida Agar……………………………………………………… 55 3.1.2.3. Brain Hearth Infusion Broth……………………………………………………… 55 3.1.3. Boyalar……………………………………………………………………………... 56 3.1.4. Tavşan Plazması…………………………………………………………………… 56 3.1.5. PZR’da Kullanılan Solüsyonlar…………………………………………………… 56 3.1.5.1. TBE Buffer………………………………………………………………………. 56 3.1.5.2. Gel Loading Buffer……………………………………………………………… 56 3.1.6. Primerler……………………………………………………………….…………… 56 3.1.7. Kullanılan Cihazlar………………………………………………………………… 57 3.1.8. Agaroz Jel………………………………………………………………………… 57 3.1.9. Marker……………………………………………………………………………… 58 3.2. Yöntem……….……………………………………………………………………… 58 3.2.1. Örneklerin SDA’a Ekimi ve Gram Boyama……………………………………… 58 3.2.2. Germ Tüp Testi………………………………………………………..…………… 58 3.2.3. Örneklerin Kromojenik Agar’a Ekimi…………………………………………….. 58 3.2.4. Moleküler İdentifikasyon………………………………………………………….. 59 3.2.4.1. DNA Ekstraksiyonu……………………………………………………………… 59 3.2.4.2. DNA’nın Elektroforezi ve Saflık Kontrolü……………………………………… 60 3.2.4.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu……………………………………………………. 60 3.2.4.4. Sekans Analizi …….…………………………………………………………….. 61 4. BULGULAR………………………………………………………………………..…. 62 4.1. İzolasyon …………………………..………………………………………………… 62 4.2. İdentifikasyon………………………………………………………………………… 62 4.2.1. Geleneksel Yöntem………………….. ……….…………………………………… 62 4.2.2. Kromojenik Agar………………... ………………………………………………... 63 4.2.3. Sekans Analizi……………………………………………………………………… 64 4.3. Sonuçların Karşılaştırılması………………………………………………………….. 65 5. TARTIŞMA…………………………………………………………………………… 70 6. SONUÇ ve ÖNERİLER………………………………………………………….…… 81 KAYNAKLAR………………………………………………………………………….... 83 ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………………………………. 98 SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ AFLP : Amplified Fragment Lenght Polymorphism AP-PZR : Arbitrarily Primed PZR BHIB : Brain Hearth Infusion Broth cAMP : Siklik Adenozin Mono Fosfat cGMP : Siklik Guanozin Mono Fosfat CDC : Center for Diseases Control and Prevention CLSI : The Clinical and Laboratory Standarts Institute CMT : California Mastitis Testi ETS : Eksternal Transcribed Spacer IFN : İnterferon Ig : İmmunglobulin ITS : İnternal Transcribed Spacer IL : İnterlökin KOH : Potasyum Hidroksit M fazı : Mycelial faz MLEE : Multi Locus Enzim Elektroforezi NNIS : National Nosocomial Infection Surveillance NK : Natural Killer NTS : Non-Transcribed Spacer PZR : Polymerase Chain Reaction PZR-SSCP : PZR-Single Strand Conformation Polymorphism PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis QSMs : Quorum-Sensing Molecules RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA REE : Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri REP-PZR : Repetetive Sequence-based PZR RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymophism SAP : Salgısal Aspartik Proteinaz SDA : Sabouraud Dekstroz Agar Spp. : Species SSDB : Sıvı Saboroud Dekstroz Besiyeri SSGB : Sıvı Saboroud Glukozlu Besiyeri Th : T helper TNF : Tümör Nekrozis Faktör W-O : White-Opac Y fazı : Yeast fazı RESİMLER DİZİNİ Resim 1. Maya hücresi, pseudohif ve gerçek hif…………………………………. 11 Resim 2. C. albicans’ta germ tüp oluşumu ve C. tropicalis’in yalancı hife benzeyen yapıları……………………………………………………………………. 42 Resim 3. ITS bölgeleri ………………………………………………….………… 51 Resim 4. Kromojenik Candida besiyerinde C. albicans, C. tropicalis, C. krusei … 59 Resim 5. Sekans analizinin yapılışı..…………….…………………………………. 61 Resim 6. Germ tüp testi pozitif bir izolatın Gram boyaması ….…………………… 62 Resim 7. İzolatların kromojenik Candida agarda görünümleri………………….. 63 Resim 8. İzolatların kromojenik Candida agarda üreme sonucuna göre tür dağılımı……………….....……………….....……………….....………… 63 Resim 9. İzolatların PZR sonrasında jel elektroforez görüntüleri………………..... 64 Resim 10. İzolatların sekans sonucuna göre tür dağılımları ……………….............. 65 TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Alexopulos tarafından 1979’da yapılan sınıflandırma ……………………. 9 Tablo 2 Fungal rRNA genlerinin amplifikasyonunda kullanılan primerler………... 57 Tablo 3 PZR işlemine ait ısıl döngü ve süre diyagramı……………………………. 61 Tablo 4. Geleneksel yöntem, kromojenik agar ve sekans analizi ile identifikasyon sonuçlarının karşılaştırılması……………………………………………… 66 Tablo 5. İzolatların üç yöntemle identifikasyon sonuçlarının karşılaştırılması…….. 67-69	tr_TR
dc.language.iso	tur	tr_TR
dc.rights	info:eu-repo/semantics/embargoedAccess	tr_TR
dc.subject	Candida	tr_TR
dc.subject	Subklinik Mastitis
dc.subject	İdentifikasyon
dc.subject	Geleneksel Yöntem
dc.subject	Kromojenik Agar
dc.subject	Sekans Analizi
dc.subject	Subclinical Mastitis
dc.subject	Identification
dc.subject	Chromogenic Agar
dc.subject	Conventional Method
dc.subject	Sequence Analysis
dc.title	Mastitisli sığır sütlerinden izole edilen candida türlerinin moleküler tanısı	tr_TR
dc.type	doctoralThesis	tr_TR
dc.contributor.department	Adnan Menderes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı	tr_TR