Deneysel olarak oluşturulan fibrosarkomalarda programlanmış hücre ölümünün çekirdekteki dna parçalanması tayini ve immunohistokimyasal olarak gösterilmesi

Abstract

Fibrosarkom mezenkimal dokudan köken alan bag dokunun kötü huylu tümörü olup daha çok kedi ve köpeklerde görülmekle birlikte tüm hayvan türlerinde ortaya çıkabilir. Hızlı ve infiltratif büyüyen bir tümördür. Rodentlerde en yaygın görülen mezenkimal tümörlerdendir ve ratlarda spontan olarak sekillenme olasılıgı % 1-3, farelerde görülme olasılıgı ise % 1-6 düzeyindedir. Apoptozis ise; gelismis organizmalarda hücreler arası iliskilerin geregi olarak gereksinim duyulmayan ve fonksiyonları bozulan hücrelerin, çevreye zarar vermeden programlı ölümüdür. Kanserlerde erken teshis yanında prognozun tayini, hastanın yasamını uzatmada ve daha uygun tedavi sekillerinin tespit edilmesinde büyük önem tasımaktadır. Özellikle kedilerde ası yerlerinde gelisen fibrosarkomlar önemli bir problem olusturmakta ve bunun en basta gelen sebebi olarak ise ası yerlerinde olusan kronik yangılar ileri sürülmektedir. Son dönemlerde kanser üzerine yapılan çalısmalarda programlı hücre ölümünün önemli rol oynadıgı bilinmektedir. Çalısmada ratlarda deneysel olarak 3- metilkolantren ile olusturulan fibrosarkomlarda programlı hücre ölümü iki ayrı metotla gösterilmistir. Böylece fibrosarkom ile programlı hücre ölümü arasındaki iliski incelenmistir. Aynı zamanda ELISA yöntemiyle DNA hasarı tespiti ve programlanmıs hücre ölümünün immunohistokimyasal olarak saptanması karsılastırılmıstır. Arastırmanın materyalini 16 adet 8 haftalık agırlıkları 150-200 gram olan erkek Spraque Dawley türü rat olusturdu. Ratlar her grupta 8 adet olmak üzere iki gruba ayrıldı. Birinci grup kontrol, ikinci grup deneme grubunu olusturdu. Hayvanlara tüm deney boyunca kuru pelet yem ve içme suyu ad libitium olarak verildi. Deneme süresi 150-210 gün sürdü. Deneme süresinin basında deneme grubundaki ratların boyun bölgelerinin dorsaline 0,25 ml susam yagında çözdürülen 0,2 mg 3-metilcholantren fibrosarkoma olusturmak üzere deri altı yolla tek doz enjekte edildi. Kontrol grubuna ise tek doz 0,25 ml susam yagı deri altı yolla enjekte edildi. Deney süresi boyunca hayvanlar periyodik olarak kontrol edilip tümoral olusum yönünden palpe edildi. Deney süresinin sonunda ratlara eter anestezisi altında ötenazi uygulanarak nekropsileri yapıldı. Olusan tümör kitlelerinde DNA kırılmaları, ELISA yöntemiyle Roche firmasının kitleriyle bakıldı. Alınan dokulardan Bcl-2 ve Bax için immunohistokimyasal boyama yapıldı. Deneme ve kontrol grubundan alınan dokular homojenize edilip santrifüj isleminden sonra süpernatant ELISA' da kullanıldı. ELISA sonuçlarına göre deney grubunda DNA fragmentasyonu ortalama 0,262 U (=absorbans), kontrol grubundaki ratlarda ise 0,069 U olarak tespit edildi. Yani deney grubunda DNA fragmentasyonu kontrol grubuna göre yaklasık 4 katı artmıs olarak tespit edildi. Deneme ve kontrol grubundan alınan dokuların Bcl-2 ve Bax için immunohistokimyasal boyaması sonucunda, deney grubunda yogun olarak bcl-2 ve bax pozitif hücreler tespit edilmis olup tümörlerde apoptozis uyarısı alan hücrelerin bazılarının apoptozise bir süre daha gitmesi engellenirken bazılarının da artık apoptotik ölüme yönlendikleri tespit edilmistir. Elde edilen bulgular sonucunda, fibrosarkomalarda apoptozis sık görülen bir olay olup, DNA fragmentasyonu apoptozisin en önemli belirtisidir. Kanser tedavisi ile ugrasanların apoptozis, Bcl-2 ve Bax' ı göz önünde bulundurması gerektigi, literatür bilgileri dogrultusunda tümörün baslangıç evresinde apoptozisin azaldıgı, tümörün prolifiye olmasıyla birlikte apoptozisin de arttıgı kanısına varılmıstır. Fibrosarcoma is driving from mesenchimal tissue. It is one of the malign tumors and usually seen in cats and dogs, however, itcan be encountered in all animals. It is growing quite fast and invade in other tissue rapidly. It is one of mesenchimal tumor in rodents varying between 1-3 %, and in rat 1-6 %. Apoptosis used for eliminating of cells which are functioning not properly. Early diagnosis of tumors and follow up prognosis are of great impotance for extention of live of cancer patients. Especially, fibrosarcoms in cats occur in vaccation areas due to the chronic inflamatio. Recent studies on tumors showed that there is a connetion between cancers and apoptosis. In this study apoptosis in fibrosarcomas induced by 3- methylcholantrene with two different methods. Thus relationship between apoptosis and fibrosarcomas is investigated. On the other hand programmed cell death investigated using immunhystochemical and ELISA methods and differences in results are compared. Sixteen male Spraque Dawley rats used in this study. They were 8 weeks old and the body weights of the rats were between 150-200 grams. Rats were allocated into two groups each containing 8 rats. During the experiment which took between 150-210 days depending on the appearance of tumor tissue. They were allowed free access to water and feed. In order to induce fibrosarcoma in rats, at the beginning of the experiment animals were injected subcutaneusly on the neck with 0,2 mg 3-methylcholanthrene solved in 0,25 ml sesame oil. To find out weather any tumoral tissue occured animals were palpated daily. At the end of the experiment animals were killed under the ether anesthesia and necropsy is permormed. DNA fragments of tumor tissue cell were analized using ELISA (Roche), localisation of Bcl-2 and Bax was determine by immunohystochemically method. Tissues obtained from the control and the experimental animals homogenizated, centrifugated and the supernatant was used for ELISA procedure. In experimental group absorbance of the DNA fragmentation was 0,262 U but in control group it was 0,069 U. In other words absorbance of DNA fragmentation of experimental animals was 4 times higher than that of controls. Immunohystochemically there was a lot of Bcl-2 and Bax positive cells. Contrary to this in control animals there was hardly Bcl-2 and bax positive cells. This data indicates that in the tumor tissue it is observed some cells programmed to death by apoptosis but the others not. In the light of this findings we got in the present study apoptosis is encountered frequently in fibrosarcoma and fragmentation of the DNA indicates apoptosis. Researchers who are engageg in curing of cacer patients should take into concideration of levels of Bcl-2 and Bax proteins. Furthermore, smilar to the results of previous studies the rate of apoptosis seems to be very low at the beginning of the cancer however in the course of the time concomitantly the increase in proliferation of the tumor cells the rate of apoptosis increased dramatically.