Protein saflaştırılması için magnetik nano yapıların hazırlanması ve karakterizasyonu

Abstract

Son on yıldır, protein immobilizasyonu ve saflaştırılması için magnetik nano partiküllerin kullanılmasına olan ilgi oldukça artmıştır. Bu çalışmada lizozim enziminin immobilizasyonu ve saflaştırılması için yeni bir destek maddesi olarak magnetik özellikte ve nano boyutta mag-nano-p(HEMA-MAPA) polimeri sentezlenmiştir. Ligand olarak kullanılan MAPA komonomeri, metakriloilklorür ve fenilalanin amino asidinin uygun koşullarda tepkimeye girmesi ile sentezlenmiştir. Hidrofobik bir yapı olan MAPA’nın polimerik yapıya girmesi, polimerin hidrofobik özellik göstermesini sağlayarak lizozim adsorpsiyonunda hidrofobik etkileşimleri baskın hale getirmiştir. Ayrıca, mag-nano-p(HEMA-MAPA) polimerinin magnetik özellikte olması, uygulamada çeşitli avantajlar sağlamıştır. Mag-nano-p(HEMAMAPA) polimerinin karakterizasyonu için FTIR, ESR, SEM, AFM, TEM, Zeta Potansiyel, Elementel Analiz ve MALDI-TOF ölçümleri gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen partiküllerin küresel yapıda ve yaklaşık 386 nm çapında olduğu gözlenmiştir. Mag-nano-p(HEMA-MAPA) partiküllerinin spesifik yüzey alanı 580,0 m2/g olarak bulunmuştur. Polimerik yapıda magnetit partiküllerinin varlığı ESR ile araştırılmış ve g faktörü 2,2128 olarak saptanmıştır. Elementel analiz ile polimerik yapıdaki MAPA içeriği 4,30 x 10-3 mmol/g polimer olarak tespit edilmiştir. Magnano- p(HEMA-MAPA) polimerine lizozim adsorpsiyonu farklı ortam koşullarında (pH, iyonik şiddet, lizozim derişimi, sıcaklık) kesikli sistemde incelenmiştir. Magnano- p(HEMA-MAPA) polimerine maksimum lizozim adsorpsiyonu 1,0 mg/mL lizozim derişiminde ve 1,0 M Na2SO4 içeren ortamda 517 mg/g polimer, nanop( HEMA)’ya non-spesifik lizozim adsorpsiyonu değeri ise 24,0 mg/g polimer olarak bulunmuştur. Desorpsiyon deneyleri ile polimerin tekrar kullanılabileceği gösterilmiştir. İlaveten serbest ve immobilize lizozimin ortam koşullarına göre aktivite ölçümleri yapılarak, optimum sıcaklık, optimum pH, depo kararlılığı, ısıl kararlılığı ve işlemsel kararlılığı incelenmiş ve kinetik sabitler belirlenmiştir. Sentezlenen polimerin bir uygulaması olarak yumurta akından lizozim enziminin saflaştırılması çalışmaları yapılmıştır. Saflaştırma işlemleri sonunda lizozim enzimi % 78,57 aktivite geri kazanımı ile 657 kat saflaştırılmıştır. Enzimin saflığı SDSPAGE ile görüntülenmiş Bio-LC ile saflık oranı % 96 olarak bulunmuştur.

During the past decade, much attention has been paid toward synthesis of magnetic nano sized particles and their use for immobilization and purification of proteins. In this work, magnetic nano sized mag-nano-p(HEMA-MAPA) polymer was synthesized and used as support for lysozyme immobilization and purification. MAPA comonomer was synthesized from methacryloylchloride and phenylalanine under suitable reaction conditions and was used as ligand. Being a hydrophobic structure, incorporation of MAPA to the polymer renders the polymer hydrophobic and provides a hydrophobic medium for lysozyme adsorption. Additionally, magnetic property of mag-nano-p(HEMA-MAPA) polymer provides several advantages on application. Characterization of mag-nano-p(HEMA-MAPA) polymer was conducted using FTIR, ESR, SEM, AFM, TEM, Zeta potential, Elemental Analysis and MALDI-TOF. Particles synthesized were found to be spherical in shape with approximately 386 nm diameter. Specific surface area of mag-nano-p(HEMA-MAPA) particles was calculated to be 580.0 m2/g. ESR was used for the detection of magnetite existence in the polymeric structure and g factor was measured to be 2.2128. Elemental analysis resulted 4.3 x 10-3 mmol MAPA per gram polymer. Adsorption of lysozyme onto mag-nano-p(HEMAMAPA) polymer was investigated in batch system under various medium conditions (i.e. pH, ionic strength, lysozyme concentration, temperature). Maximum lysozyme adsorption on mag-nano-p(HEMA-MAPA) polymer was measured to be 517 mg/g polymer at 1.0 mg/mL and 1.0 M concentrations of lysozyme and Na2SO4, respectively. Non-specific adsorption of lysozyme on nano-p(HEMA) was calculated to be 24.0 mg/g polymer. Desorption assays indicated that polymer was reusable. Additionally, activity measurements of free and immobilized lysozyme were conducted in order to determine optimum temperature, optimum pH, storage stability, heat stability and operational stability as well as kinetic parameters. Purification of egg white lysozyme using the polymer synthesized was achieved with a high yield of 78.57 % recovery and 657 purification fold. Purity of enzyme was demonstrated using SDS-PAGE and measured as 96 % using Bio-LC.