GARDNERELLA VAGİNALİS’E ETKİLİ BAKTERİYOFAJ İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU

Abstract

Amaç: Bu çalışma, kadınların yaklaşık %50’sini etkileyen ve antibiyotik tedavisine rağmen yüksek nüks oranlarıyla seyreden bakteriyel vajinoz (BV) enfeksiyonuna alternatif bir tedavi yaklaşımı geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu doğrultuda, BV’nin başlıca etkeni olan Gardnerella vaginalis’e karşı etkili bakteriyofaj tespiti ve moleküler düzeyde karakterize edilmesi hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Araştırma, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Araştırma Hastanesi Jinekoloji biriminden toplanan vajinal örneklerle gerçekleştirilmiştir. Vajinal örnekler Nugent skorlaması yapılarak hasta (BV’li) ve sağlıklı gruba kategorize edilmiş, G. vaginalis’in izolasyonu için hasta örnekleri kullanılmıştır. G. vaginalis’in fenotipik identifikasyonunda %5 insan kanı içeren Gardnerella için seçici besi ortamları kullanılmıştır. Morfolojisi G. vaginalis’e benzeyen ve beta hemoliz gösteren izolatlar mikroskobik olarak incelenmiştir. İzolatların moleküler identifikasyonu G. vaginalis’e spesifik primerler kullanılarak yapılmıştır. G. vaginalis’e etkili bakteriyofaj izolasyonu için vajinal hasta örnekleri kullanılmıştır. G. vaginalis üzerine etkili fajların taranması için spot test ve ikili agar kaplama yöntemi uygulanmıştır. Her iki yöntemde de faj varlığına işaret eden zon ve plak yapıları gözlemlenmiş olsa da, yeterli faj titresi elde edilemediği için klasik yöntemlerle faj DNA’sının izole edilmesi ve doğrudan karakterizasyonu mümkün olmamıştır. Bu sebeple, alternatif olarak, spot test ve ikili agar sonuçlarına göre pozitif olarak değerlendirilen hasta örneği kullanılarak doğrudan faj total DNA (Fajom) izolasyonu adımına geçilmiştir. Fajom DNA izolasyonu için uzun süreli santrifüj işleminin ardından Fenol/Kloroform yöntemi kullanılmıştır. İzole edilen total DNA’dan fajom analizi yeni nesil dizileme teknolojisi (NGS) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Biyoinformatik analiz Kbase otomatik işleme hattı ve RASTtk v1.073 anotasyon hattı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen faj kontiğinin moleküler karakterizasyonu için genom üzerinde kodlanan ve G. vaginalis üzerine inhibitör etkisi olabilecek enzimler araştırılmıştır. Faj endolizinin rekombinant eldesi için hedef gene özgü primerler tasarlanmış ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR amplifikasyonu sonrası pozitif olan gen ürünü klonlama amacıyla pet30a vektörüne aktarılmıştır. Ardından Escherichia coli BL21 suşuna transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Transformasyon sonrası pozitif klonlar seçilerek protein ekspresyonu aşamasına geçilmiştir. Rekombinant proteinin saflaştırılması için IMAC (immobilize metal afinite kromatografi) yöntemi kullanılmıştır. Saflaştırılan rekombinant endolizinin enzimatik aktivitesi ve moleküler ağırlığı, sırasıyla zimogram analizi ve SDS-PAGE yöntemi ile belirlenmiştir. Endolizinin G. vaginalis üzerine etkisi ise biyofilm önleme ve mevcut biyofilmi bozma deneyleri ile bakteri azaltma testi yapılarak belirlenmiştir. Bulgular: Çalışma kapsamında toplam 150 hastadan vajinal örnek toplanmıştır. Nugent analizi sonucunda 52 örneğin bakteriyel vajinoz (BV) ile uyumlu olduğu belirlenmiştir. Hasta örnekleri kullanılarak gerçekleştirilen izolasyon sonucunda beş izolatın G. vaginalis koloni morfolojisine benzer olduğu belirlenmiştir. İzolatların moleküler identifikasyonu ve sekans analizi sonucunda iki izolatın G. vaginalis’e ait olduğu doğrulanmıştır. Analiz sonucu ham veri setinin, ortalama uzunluğu 151 bps olan toplam 2,664,308,544 baz çiftine karşılık gelen 17,908,938 dizi içerdiği bulunmuştur. Diziler arasındaki bir kontik Gardnerella-ilişkili bir fajla %93 benzerlik göstermiştir. Çalışmaya bu faj kontiğiyle devam edilmiştir. Faj kodlu proteini rekombinant olarak üretmek ve saflaştırmak için genom üzerinde kodlanan faj proteini 1,4-beta-Nacetylmuramidase seçilmiştir. Rekombinant enzim, rpLys olarak adlandırılmış ve enzimatik aktivitesi zimogram analizi ile gösterilerek, molekül ağırlığı 43 kDa olarak belirlenmiştir. rpLys’nin G. vaginalis biyofilmleri üzerine etkisinin araştırılmasında referans olması amacıyla S. aureus … ve E. coli .. suşları da kullanılmıştır. Üç farklı konsantrasyonda (75, 150 ve 300 µg/ml) denenen rpLys’in, biyofilm oluşumunu engelleme açısından S. aureus’da yaklaşık %70, E. coli’de yaklaşık %40 ve G. vaginalis’de %90 oranında etkili olduğu belirlenmiştir. Endolizinin olgun biyofilmleri bozma yeteneği ise, S. aureus’da yaklaşık % 40, E. coli’de % 10 ve G. vaginalis’de % 60 olarak belirlenmiştir. Endolizinin bakteri azaltma testi canlı bakteri sayımı yapılarak belirlenmiştir. Kontrol grubuna kıyasla rpLys endolizinin G. vaginalis’in büyümesini 16. saatten itibaren inhibe ettiği belirlenmiştir. Sonuç: Bu tez kapsamında BV tanısı almış hastalardan G.vaginalis suşları izole edilmiş ve tanılanmıştır. Rekombinant olarak üretilen ve saflaştırılan rpLys G. vaginalis üzerine inhibitör etki göstermiştir. Yapılan in vitro analizlerde bu proteinin G. vaginalis biyofilmlerini önleme ve olgun biyofilmleri parçalamada etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca yapılan bakteri azaltma testinde, rpLys’in G. vaginalis’in büyümesi üzerine inhibisyon etkisi olduğu belirlenmiştir. Elde edilen bulgular, lizojenik fajların kodladığı endolizinlerin terapötik potansiyele sahip olabileceğini desteklemektedir. Özellikle BV tedavisinde kullanılabilecek antibiyotiklere alternatif, faj kökenli bir antimikrobiyal ajan karakterize edilmiştir.