Bacillus subtilis’E AİT SELÜLAZ GENİNİN KLONLANMASI VE REKOMBİNANT SENTEZİ

Abstract

Amaç: Selülaz enzimini Rekombinant olarak üretmek. Gereç ve Yöntem: Adnan Menderes Üniversitesi Rekombinant DNA ve Rekombinant Protein Araştırma uygulama Merkezi REDPROM laboratuvarının envanterinde bulunan 12 farklı Bacillus subtilis izolatının gen kaynağı adayı olarak kullanıldı. Spesifik olarak hazırlanan Forward ve Reverse primerler ile PCR yöntemi ile klonlanan selülaz geni yine aynı laboratuvarın envanterinde bulunan Escherichia coli BL21 bakterisine kimyasal transformasyon yöntemi ile aktarıldı. Aktarılma sonrasında kompetent hücreler besiyerinde inkübe edildikten sonra plasmid izolasyonu ile pET30a+ plazmidi izole edildi ve restriksiyon enzimi ile kesilerek spesifik primerler ile PCR işlemine tabi tutuldu. Bu işlemden sonra agaroz jelde görüntüleme yapılarak doğrulanan insert DNA dizi analizi yapmak üzere sekansa gönderildi. DNA sekansı gen bankası ile karşılaştırılıp doğrulandıktan sonra protein üretimi sağlandı ve IMAC ile saflaştırılma işlemi gerçekleştirildi. Saflaştırılan protein SDS-PAGE yöntemi ile görüntülendi. En son işlem olarak, seçilen koloni %1 Kongo kırmızısı içeren Ksilan agar besiyerine ekilerek enzimatik aktivitesi teste tabi tutuldu. Bulgular: Bacillus subtilis izolatlarından iki suşun selülaz genine sahip olduğu PCR yöntemi ile doğrulandı. Ardından transformasyonu gerçekleştirilen inser+pET30a(+) Rekombinant gen içeren transformant E. coli BL21 hücrelerinden DNA izolasyonu sonrası klonlama primerleri ile PCR yapılarak sekans dizisi gen bankası ile karşılaştırılıp doğrulandı. Proteinin saflaştırılması sonrasında SDS-PAGE yöntemi ile beklenen aralıkta bir sonuç alındı ve son olarak aktivite ölçümü gerçekleştirildi. Sonuç: Bu çalışma sonucunda Bacillus subtilis’e ait olan selülaz geni Rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak E.coli BL21’e klonlandı. Bu sayede selülazın laboratuvar ortamında büyük ölçekte üretilmesi adına büyük bir adım atılmış oldu.