Trichomonas vaginalis sialidaz geninin Escherichia coli’de klonlanıp biyolojik aktivitesinin araştırılması

Abstract

ÖZET

Trichomonas vaginalis SİALİDAZ GENİNİN E.coli’DE KLONLANIP BİYOLOJİK AKTİVİTESİNİN ARAŞTIRILMASI Başbülbül G. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Parazitoloji Programı Doktora Tezi, Aydın, 2024. Amaç: Bu araştırma bir protozoon parazit olan T.vaginalis’in siyalidaz enzimini kodlayan geni klonlamak ve rekombinant organizmadan elde edilen ham ve saflaştırılmış siyalidaz enziminin biyolojik aktivitesini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Gereç ve Yöntem: Araştırmada ADÜ Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı’ndan temin edilen T. vaginalis parazitinin DNA’sı kullanılmıştır. PCR ile çoğaltılan siyalidaz geni, resktriksiyon ve ligasyon aşamalarından sonra, pET30a plazmidi üzerinde kimyasal transformasyon ile E.coli bakterisine aktarılmış ve üretilen siyalidaz proteini saflaştırılmıştır. Siyalidaz aktivitesi ham ve saflaştırılmış örneklerde, Nöraminidaz deney kiti ile araştırılmıştır. Bulgular: PCR ile çoğaltılan siyalidaz geninin büyüklüğü yaklaşık 1050 bp’dir. Sekans analizi sonucu amplikonun T. vaginalis G3 suşuna ait siyalidaz enzim geni ile % 99.69 oranında identiktir. pUC19 ve Pet30 plazmidleriyle yapılan transformasyon sonucu Sia32 olarak adlandırılan klon seçilmiş ve üretilen rekombinant proteinin molekül ağırlığı 44.5 kDa olarak hesaplanmıştır. Saflaştırma için yapılan optimizasyon denemelerinde en iyi metodun imidazolsüz başlangıç ve 25-200 mM lık imidazol elüsyon adımlarını içeren yöntem olduğu gösterilmiştir. Ham ve saflaştırılmış siyalidaz içeren örneklerde nöraminidaz deney kiti ile enzimin biyolojik aktivitesi doğrulanmış ve saf örneklerde enzim aktivitesinin daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Sonuç: Bu çalışmada T. vaginalis parazitine ait siyalidaz geni klonlanarak saflaştırılmış ve biyokimyasal aktivitesi ticari deneme kiti ile doğrulanmıştır. Böylece, laboratuvarımızda rekombinant siyalidaz üreten E.coli BL21 suşu oluşturulmuştur. Rekombinant suş, siyalidaz enziminin diğer biyolojik özelliklerinin çalışılması ve siyalidaz inhibitörü geliştirmek için kaynak olacaktır. ÖZET

Trichomonas vaginalis SİALİDAZ GENİNİN E.coli’DE KLONLANIP BİYOLOJİK AKTİVİTESİNİN ARAŞTIRILMASI Başbülbül G. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Parazitoloji Programı Doktora Tezi, Aydın, 2024. Amaç: Bu araştırma bir protozoon parazit olan T.vaginalis’in siyalidaz enzimini kodlayan geni klonlamak ve rekombinant organizmadan elde edilen ham ve saflaştırılmış siyalidaz enziminin biyolojik aktivitesini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Gereç ve Yöntem: Araştırmada ADÜ Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı’ndan temin edilen T. vaginalis parazitinin DNA’sı kullanılmıştır. PCR ile çoğaltılan siyalidaz geni, resktriksiyon ve ligasyon aşamalarından sonra, pET30a plazmidi üzerinde kimyasal transformasyon ile E.coli bakterisine aktarılmış ve üretilen siyalidaz proteini saflaştırılmıştır. Siyalidaz aktivitesi ham ve saflaştırılmış örneklerde, Nöraminidaz deney kiti ile araştırılmıştır. Bulgular: PCR ile çoğaltılan siyalidaz geninin büyüklüğü yaklaşık 1050 bp’dir. Sekans analizi sonucu amplikonun T. vaginalis G3 suşuna ait siyalidaz enzim geni ile % 99.69 oranında identiktir. pUC19 ve Pet30 plazmidleriyle yapılan transformasyon sonucu Sia32 olarak adlandırılan klon seçilmiş ve üretilen rekombinant proteinin molekül ağırlığı 44.5 kDa olarak hesaplanmıştır. Saflaştırma için yapılan optimizasyon denemelerinde en iyi metodun imidazolsüz başlangıç ve 25-200 mM lık imidazol elüsyon adımlarını içeren yöntem olduğu gösterilmiştir. Ham ve saflaştırılmış siyalidaz içeren örneklerde nöraminidaz deney kiti ile enzimin biyolojik aktivitesi doğrulanmış ve saf örneklerde enzim aktivitesinin daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Sonuç: Bu çalışmada T. vaginalis parazitine ait siyalidaz geni klonlanarak saflaştırılmış ve biyokimyasal aktivitesi ticari deneme kiti ile doğrulanmıştır. Böylece, laboratuvarımızda rekombinant siyalidaz üreten E.coli BL21 suşu oluşturulmuştur. Rekombinant suş, siyalidaz enziminin diğer biyolojik özelliklerinin çalışılması ve siyalidaz inhibitörü geliştirmek için kaynak olacaktır.