Kainik Asit ile Eksitotoksisite Oluşturulmuş Nöroblastoma Hücrelerinde GLT-1 (Glutamat Transporter 1) Yıkım Yolağının, Sırt4 (Sirtuin 4) ile Düzenlenmesinin Araştırılması

Abstract

Amaç: Çalışmada; SIRT4’ün, nöroblastoma hücrelerinde, GLT-1'in ekspresyonunu ve degradasyonunu nasıl düzenlediği ve GLT-1 promotorundaki transkripsiyon faktörleri üzerine etkisinin aydınlatılması amaçlandı. Bunun yanında özellikle kainik asit kaynaklı eksitotoksisite durumunda bu düzenlemenin nasıl değiştiğinin gözlemlenmesi hedeflendi. Gereç ve Yöntem: SH-SY5Y insan nöroblastoma hücre hattında, SIRT4 genini susturmak için SIRT4 shRNA içeren lentiviral partiküller kullanıldı ve SIRT4 geni susturulmuş kararlı SH-SY5Y hücre hattı elde edildi. SIRT4’ün susturulduğunu göstermek Western Blot yöntemi kullanıldı. Uygun şartları sağlayan tek bir hücre hattı seçilerek diğer deneylerde kullanılmak üzere çoğaltılmaya devam edildi. Kontrol SH-SY5Y hücreleri ve SIRT4 geni susturulmuş SH-SY5Y hücreleri kainik asit (1mM) ile muamele edilerek eksitotoksisite modeli oluşturuldu. Toplam dört deney grubu meydana getirildi. Bunlar; kontrolgrubu, kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulmuş grup, SIRT4 susturulmuş grup ve kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulan ve SIRT4 susturulmuş gruptur. Dört deney grubundaki GLT-1 ifadeleri Western Blot yöntemi kullanılarak analiz edildi. Dört deney grubundaki GLT-1 mRNA seviyeleri qPCR yöntemi kullanılarak belirlendi. GLT-1 promotoru ve transkripsiyon faktörlerinin (CREB ve REST) etkileşimi CHIP (Kromatin İmmünopresipitasyon) metodu ile dört deney grubunda gösterildi. Bulgular: Kontrol grubu, Kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulmuş grup, SIRT4 susturulmuş grup ve Kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulan ve SIRT4 susturulmuş gruplarındaki GLT-1 ekspresyon düzeyinin belirlenmesi için her gruptan protein izolasyonu yapılarak Western Blot yöntemi uygulandı. Elde edilen sonuçlarda GLT-1’in nöroblastoma hücrelerinde oligomerik yapılar oluşturduğu görüldü. SIRT4 geni susturulmuş iki grup arasında eksitotoksisite oluşturmak toplam GLT-1 ifadesini istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldığı gözlemlendi. Bunun yanında eksitotoksisite oluşturulmuş iki grup arasında SIRT4 genini susturmanın yine toplam GLT-1 ifadesini istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalttığı bulundu. Ardından dört deney grubunda GLT-1 mRNA seviyeleri, qPCR yöntemi kullanılarak belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre dört deney grubu arasında, GLT-1 mRNA seviyesinin, istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermediği gözlemlendi. Sonuç: Elde edilen sonuçlar, nöroblastoma hücrelerinde SIRT4’ün susturulmasının ve eksitotoksisite durumunun GLT-1 ifadesini, mRNA düzeyinden ziyade protein düzeyinde etkilediğini göstermektedir.