Rabdomyosarkom hücre dizisinde onkogenik WIP1 fosfatazın ve DNA hasarı cevabı regülasyonunun araştırılması

Abstract

Amaç: RMS A204 hücre hattında onkojenik Wip1 fosfatazın genotoksik stres kaynaklı (etoposid) apoptoz aktivasyonu üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Çalışmada, A204 hücrelerinde etoposid, GSK2830371 ve etoposid + GSK2830371 kullanılarak; Hücre canlılığı, 24-48-72 saatlik inkübasyonun ardından MTT ile analizi edildi. Apoptozu indüklemek için 24-48-72 saatlik inkübasyonun ardından Annexin V testi yapıldı. WIP1, GAPDH, fosfo p53 ve total p53 proteinlerinin seviyeleri, 48 saatlik inkübasyonun ardından Western blot analizi ile ölçülmüştür. Bulgular: Etoposide'in GSK ile kombinasyonu halinde zamana ve doz artışına bağlı olarak metabolik aktiviteyi azalttığı MTT testi ile belirlenmiştir. Etoposid ve GSK kombinasyonun da zaman artışına bağlı olarak apoptoz miktarında artış olduğu Annexin V testi ile saptanmıştır. Etoposid + GSK kombinasyonunun Wip1’in baskılanmasıyla fosfo p53 proteini seviyesinde artışa sebep olduğu Western Blot analizi ile tespit edilmiştir. Sonuç: bu çalışmada, A204 rabdomyosarkom hücre hattında PPM1D amplifikasyonu nedeniyle aşırı artan Wip1 ekspresyonunu inhibe ederek genotoksik stres oluşturan bir kemoterapi ajanı olan etoposidin etkinliği ve bu hücrelerin apoptoz yoluyla kemoterapiye yanıtı araştırıldı.

Objective: It was aimed to investigate the effect of oncogenic Wip1 phosphatase on genotoxic stress-induced (etoposide) apoptosis activation in RMS A204 cell line. Material and Methods: In the study, using etoposide, GSK2830371, and etoposide + GSK2830371 in A204 cells; Cell viability was tested by MTT analysis after 24-48-72 hours of incubation. Annexin V test was performed at the end of the 24-48-72 hours period to induce apoptosis. The levels of WIP1, GAPDH, phospho p53, and total p53 proteins were measured by Western blot analysis at 48 hours. Results: It has been determined by the MTT test that Etoposide reduces metabolic activity depending on time and dose increase in combination with GSK. It was determined by the Annexin V test that the combination of etoposide and GSK also increased the amount of apoptosis depending on the increase in time. It was determined by Western blot analysis that the combination of etoposide + GSK caused an increase in the level of phospho p53 protein by suppressing Wip1. Conclusion: in this study, the efficacy of etoposide, a chemotherapy agent that creates genotoxic stress by inhibiting the excessively increased expression of Wip1 due to PPM1D amplification in A204 rhabdomyosarcoma cell line, and the response of these cells to chemotherapy were investigated through apoptosis.