GLT-1 (glutamat transporter-1) yıkım yolağının glioblastoma hücrelerinde incelenmesi

Abstract

Glioblastoma multiform, glia hücrelerinden türeyen primer beyin tümörüdür. Tümörün büyümesi, glioma hücrelerini çevreleyen nöronların eksitotoksisite yolu ile ölmesiyle gerçekleşir. Eksitotoksisite, sinaptik boşlukta aşırı glutamat birikimi ile oluşur ve epilepsi, felç ve nörodejeneratif hastalıklar gibi beyin hastalıkları ile glioblastoma gibi beyin tümörlerinde görülür. Glutamat, merkezi sinir sisteminde birçok nörolojik işleve sahip olan bir nörotransmitterdir ve beyinde yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Sinir hücrelerinin uyarılması ile presinaptik nörondan sinaptik boşluğa glutamat salınır ve postsinaptik nörondaki glutamat reseptörleri uyarılır. Glial hücrelerde ve nöronlarda da bulunan glutamat taşıyıcılarının sinaptik boşluktan glutamatı toplaması ile iletim sonlanır. Sinaptik boşluktaki glutamatın büyük çoğunluğu Glutamat Transporter 1 (GLT-1) tarafından toplanmaktadır. Glutamat taşınım yolağında, Protein Kinaz C (PKC), Nedd4-2 ubiquitin ligazı fosforile ederek aktive etmekte, Nedd4-2, GLT-1’i ubiquitine etmekte ve GLT-1 degrade olmaktadır. Bu proses, GLT-1’in hücre yüzeyi ekspresyonunun, dinamik olarak değişimini ve kontrol edilmesini sağlamaktadır. Sinaptik boşlukta glutamat birikimi olmadığı durumda, GLT-1 ubiquitinasyona uğrar, yıkılır ve dolayısıyla yüzey ifadesi azalır. Sinaptik boşlukta glutamat biriktiğinde ise, GLT-1 yüzey ifadesi artar. Bu dinamik prosesdeki bozukluklar, hücreler arasındaki düşük glutamat seviyesini artırarak, beyin hastalıklarında görülen eksitotoksisiteye neden olur. Sirtüinler, hücre içindeki çeşitli proteinleri posttranslasyonel modifikasyonlar için hedef alan protein deasetilaz enzim sınıfıdır. Yalnızca deasetilasyon değil, ADP-ribozilasyonu gibi posttranslasyonel modifikasyonları da gerçekleştirirler. Sirtuinlerin, nörodejeneratif hastalıklarda rollerinin bulunduğu bilinmektedir. Sirt4'ün, glioma hücrelerinde, glutamat metabolizmasını modüle ederek eksitotoksisiteyi engellediği daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Ayrıca, Sirt4’ün yokluğunda, GLT-1’e bağlı glutamat alınımının azaldığı bulunmuştur. Bu çalışmada amacımız, Sirt4’ün, glutamat metabolizmasını ve GLT-1’in xii işleyişini nasıl kontrol ettiğini araştırmak ve glia ve glioblastoma hücrelerinde karşılaştırmalı olarak incelemektir. Bu nedenle, IHA (immortalized human astrocytes-glia) ve U87 (glioblastoma) hücre hatlarında Sirt4 ve GLT-1 protein ifade seviyeleri incelenmiştir. GLT-1 yıkım yolağında görev alan Ubiquitin ve Protein Kinaz C (PKC) proteinlerinin ekspresyon seviyeleri, western blot tekniği ile incelenmiştir. Ayrıca, glia ve glioblastoma hücrelerinde, medyumda birikmiş olan glutamatın seviyesi, glutamat assay ile ölçülmüştür. Çalışma sonucunda, glioblastoma hücrelerinde ubikitinasyonun istatiksel olarak anlamlı olmasa da azaldığı ve GLT-1’in arttığı görülmüştür. GLT-1 seviyesini kontrol ettiği daha önceki çalışmalarda gösterilmiş olan Sirt4 ise beklenilen şekilde artmıştır. PKC protein seviyesi ise, glioblastoma hücrelerinde istatiksel olarak anlamlı olmasa da azalmıştır. Glutamat assayde, glioblastoma hücrelerinde salınmış glutamat seviyesi, glia hücrelerine göre azalmış olarak gözlenmiştir. Bunun nedeninin, glia hücrelerine oran ile büyük bir hızla çoğalan U87 hücrelerinin, hiç medyum değiştirilmeden yapılan bu assayde, yüksek oranda ölüm gösterdikleri için total glutamat salınımının daha az olması olabileceği düşünüldü. Ayrıca, Sirt4 ve GLT-1, glioblastomada artış gösterdiği için, birikmiş glutamatın toplanarak azalmış olması, beklenen bir sonuçtur. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, glioblastomada, eksitotoksisitenin GLT-1 yıkım ya da aktivasyon yolağının modüle edilerek engellenebileceğini, dolayısyla, yeni ilaç ve tedavi geliştirme alanları oluşabileceğini göstermektedir.

Glioblastoma multiform is a primary brain tumor derived from glial cells. The tumor growth occurs via death of neurons surrounding glioma cells dying due to excitotoxicity. Excitotoxicity is caused by the excessive accumulation of glutamate in the synaptic cleft and observed in brain diseases such as epilepsy, stroke, and neurodegenerative diseases, as well as brain tumors such as glioblastoma. Glutamate is a neurotransmitter that has many neurological functions in the central nervous system and is found in high concentrations in the brain. After the stimulation of the nerve cells, glutamate is released from the presynaptic neuron into the synaptic cavity resulting in the induction of the glutamate receptors on the postsynaptic neuron. Glutamate neurotransmission is terminated in the synaptic cleft after the clearance of glutamate via glutamate transporters, which are also present in glial cells and neurons. The vast majority of glutamate in the synaptic cavity is collected by glutamate Transporter 1 (GLT-1). In the glutamate degradation pathway, Protein Kinase C (PKC) phosphorylates Nedd4-2 ubiquitin ligase, activated Nedd4-2 ubiquitin ligase ubiquitinates and GLT-1 is degraded. This process allows for the control of the dynamic cell surface expression of GLT-1. When there is no glutamate accumulated in the synaptic cleft, GLT-1 undergoes ubiquitination and breaks down, and hence its surface expression is reduced. When glutamate accumulates in the synaptic cavity, the surface expression of GLT-1 increases. Dysfunction of this dynamic process leads to the low level of glutamatein the synaptic cleft causing excitotoxicity and brain diseases. Sirtuins are a class of protein deacetylase enzymes that target various proteins within the cell for posttranslational modifications. They perform not only deacetylation but also posttranslational modifications such as ADP-ribosylation. Sirtuins are known to have roles in neurodegenerative diseases. Sirt4 has been shown in previous studies to inhibit excitotoxicity in glioma cells by modulating glutamate metabolism. xiv Furthermore, in the absence of Sirt4, GLT-1-linked glutamate uptake was found to be reduced. Our aim in this study is to investigate how Sirt4 controls glutamate metabolism and the functioning of GLT-1 and also to examine and compare it in glia and glioblastoma cells. Therefore, Sirt4 and GLT-1 protein expression levels were studied in IHA (immunized human astrocytes-glia) and U87 (glioblastoma) cell lines. Expression levels of Ubiquitin and Protein kinase C (PKC) proteins involved in the GLT-1 degradation pathway have been demonstrated by the western blot technique. Also, in glia and glioblastoma cells, the level of glutamate accumulated in the medium was measured with the glutamate assay. As a result of the study, ubiquitination was reduced in glioblastoma cells although not statistically significantly and GLT-1 was increased. Sirt4, which has been shown in previous studies to control the level of GLT-1, was found to be increased as expected. The protein level of the PKC protein, on the other hand, was decreased in glioblastoma cells although not statistically significant. Glutamate assay showed that the levels of accumulated glutamate in the medium in glioblastoma cells were reduced compared to glial cells. The reason for this may be that U87 cells, which multiply much more rapidly compared to glia cells, have reduced levels of glutamate released, as they show a higher rate of death in this assay which was conducted without changing the medium. Additionally, since Sirt4 and GLT-1 protein levels were increased in glioblastoma cell line, the accumulated glutamate may have been reduced by the clearance from the medium by GLT-1. The results obtained in this study show that excitotoxicity in glioblastoma can be prevented by modulating the GLT-1 degradation or activation pathway, thus creating new areas of drug and treatment development.