Please use this identifier to cite or link to this item:
http://hdl.handle.net/11607/3991Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.advisor | Bozdoğan, Bülent | - |
| dc.contributor.author | Erdem Aynur, Zeynep | - |
| dc.date.accessioned | 2021-03-02T11:17:08Z | - |
| dc.date.available | 2021-03-02T11:17:08Z | - |
| dc.date.issued | 2021-03-02 | - |
| dc.date.submitted | 2020-09-09 | - |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11607/3991 | - |
| dc.description.abstract | Protozoa âleminin Apicomplexa filumunda yer alan Cryptosporidium türleri ökaryotik protozoonlardır ve tüm türleri hücre içi parazitlerdir. Cryptosporidiosis, Cryptosporidium cinsine bağlı, protozoonların neden olduğu, tüm dünyada oldukça yaygın olarak bulunan ve 100’den fazla canlı türünde görülen zoonoz bir hastalıktır. Flagellalı bir protozoon olan Trichomonas vaginalis, insanlarda üreme yolu enfeksiyonu olan trikomoniyaza neden olur.Trikomoniyaz dünyada viral olmayan cinsel yolla bulaşan en yaygın hastalıktır. T. vaginalis,idrar yolu, vajina ve prostata bulaşan, flagellalı, tek hücreli, anaerobik bir protozoondur.Sistein proteazlar hem Cryptosporidium hem de Trichomonas suşlarında önemli virulans faktörleri arasındadır. Birçok parazitte bulunan ve invazyonda önemli olan bu enzimler ilaç tasarımları için hedef olarak kabul edilirler. Bu çalışmada patojen olan Cryptosporidium parvum ve Trichomonas vaginalis türlerinin sistein proteaz genlerinin klonlanması amaçlanmıştır. Klonlamada kullanılmak amacıyla gen pozitif örnek bulmak için 63 Cryptosporidium spp ve 28 T. vaginalis örneği çalışılmış ve cryptopain için, 22(%35) ve CP39 içinse 19(%68) pozitiflik bulunmuştur. Tüm cryptopain pozitif suşların aynı zamanda cryptostatin için de pozitif olduğu saptanmıştır. Cryptopain, cryptostatin ve CP39 için pozitif saptanan örneklerden, restriksiyon enzim tanıma bölgeleri eklenerek oluşturulan primerler yardımıyla PCR yöntemiyle çoğaltılmıştır. Amplikonlar pET28a ekspresyon plazmidine yerleştirilmiş ve E.coli BL21 suşuna transformasyon yoluyla aktarılmıştır. Klonlanan cryptostatin, cryptopain ve cp39 genlerinden protein sentezlenip sentezlenmediği SDSPage yöntemiyle test edilmiştir. Transformantların sistein proteaz aktivitesinin belirlenmesi için jelatini parçalama özelliği test edilmiş sonuçta hem cryptopain hem de CP39 genleri aktarılmış E.coli BL21 suşlarının jelatinaz aktivitesi gösterdiği saptanmıştır. Cryptostatinin bu aktiviteyi önleme etkisi test edilmiş ve jelatinaz aktivitesinin önlendiği belirlenmiştir. Rekombinant olarak üretilen sistein proteazların tanıda ve tedavide kullanım potansiyeli vardır. Bu proteinlerin antijen olarak kullanılmasıyla elde edilecek antikorların tanı kitlerinde kullanım olasılığı mevcuttur. Bu proteazların hasarlı dokuda debridman olarak kullanılabileceği öngörülmektedir. Ayrıca sistein proteazların başka parazitlerde aşı antijeni olarak kullanımı üzerine çalışmalar mevcuttur. Proteaz inhibitörlerinin ise parazit enfeksiyonlarının tedavisinde ilaç olarak kullanılma olasılığı vardır. | tr_TR |
| dc.description.tableofcontents | KABUL ONAY.i TEŞEKKÜR .ii İÇİNDEKİLER.iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ.viii ŞEKİLLER DİZİNİ.ix RESİMLER DİZİNİx TABLOLAR DİZİNİ. xi ÖZET. xiii ABSTRACT . xv 1.GİRİŞ..1 2. GENEL BİLGİLER. 3 2.1. Cryptosporidium parvum... 3 2.1.1.Taksonomi .3 2.1.2. Morfolojisi.. 5 2.1.3. Genotipik Özellikleri 6 2.1.4. Virulans Faktörleri.. 8 2.1.4.1 Tutunma faktörleri.....8 2.1.4.2. Hücresel hasar verenler 10 2.1.4.3. Isı şoku proteinleri.... 10 2.1.4.4. Contingency genleri.... 11 2.1.5.Yaşam Döngüsü.... 12 2.1.5.1. Ekskistasyon (kistin açılması) dönemi .12 2.1.5.2. Merogoni dönemi ..13 2.1.5.3. Gametogoni dönemi . 14 2.1.5.4. Döllenme dönemi ......14 2.1.5.5. Ookist dönemi ..14 2.1.5.6. Sporogoni dönemi . 14 2.1.6. Epidemiyolojisi... 16 2.1.6.1.İnsanlardaki epidemiyolojisi 17 2.1.6.2 Buzağılardaki epidemiyolojisi. 24 2.1.6.3. Su Örneklerindeki epidemiyolojisi..28 2.1.7. Bulaş.. 30 2.1.8. Patogenez..32 2.1.9.Cryptosporidiosis... 33 2.1.9.1. İntestinal kryptosporidiozis...33 2.1.9.1.1. Asemptomatik taşıyıcılar...33 2.1.9.1.2. Akut Sınırlı enfeksiyon..... 34 2.1.9.1.3. Kronik enfeksiyon 34 2.1.9.1.4. Fulminant enfeksiyon ..34 2.1.9.2. Respiratuar cryptosporidiosis. 34 2.1.9.3. Hepatobiliyer cryptosporidiosis 34 2.1.9.4. Pankreatik cryptosporidiosis...... 35 2.1.10.Tanı..35 2.1.11. Tedavi ....42 2.1.12. Korunma . 43 2.2.Trichomonas vaginalis . 44 2.2.1. Tarihçe ......... 44 2.2.2 Taksonomisi . 44 2.2.3. Morfolojisi..45 2.2.3.1. Genel Morfolojisi 45 2.2.4. Beslenme ve Hareket46 2.2.5. Moleküler Yapısı 47 2.2.6. Virulans Faktörleri47 2.2.6.1. Hücre penetrasyonu(sitoaderens)ndan sorumlu virulans faktörler47 2.2.6.2. Sitotoksisite 48 2.2.6.3. Hemoliz 49 2.2.6.4. Apoptozis49 2.2.6.5. İmmun sistemden kaçış 49 2.2.7. Yaşam Döngüsü50 2.2.8. Epidemiyolojisi 51 2.2.9. Patogenez ve trikomoniyaz52 2.2.10. Tanı..........................................................................................................................53 2.2.10. 1. Direkt mikroskobik inceleme 53 2.2.10.2. Boyama 53 2.2.10.3. Kültür54 2.2.10.4.Serolojik testler54 2.2.10.5. Hızlı tanı kitleri54 2.2.10.6. Moleküler testler54 2.2.11. Tedavi 55 2.3. Proteazlar55 2.3.1. Proteazların Sınıflandırılması56 2.3.1.1. Katalitik bölgedeki işlevlerine göre proteazlar57 2.3.1.1.1.Ekzopeptidazlar 57 2.3.1.1.2.Endopeptidazlar57 2.3.1.2. Aktif bölgedeki fonksiyonel gruplarına göre proteazlar 57 2.3.1.2.1. Serin proteazlar57 2.3.1.2.2. Aspartil proteazlar 58 2.3.1.2.3. Metallo proteazlar58 2.3.1.2.4. Sistein Proteazlar58 2.3.1.3. Kaynağına göre proteazlar 58 2.3.1.3.1. Bitkisel kaynaklı proteazlar58 2.3.1.3.2. Hayvansal kaynaklı proteazlar 59 2.3.1.3.3. Mikrobiyal kaynaklı proteazlar 59 2.3.2. Parazitik Protozoonlarda Bulunan Sistein Proteazlar60 2.3.2.1. Cryptosporidium parvum’ da sistein proteazlar 60 2.3.2.2. Trichomonas vaginalis’ te bulunan sistein proteazlar65 3. GEREÇ VE YÖNTEM69 3.1.Gereç69 3.1.1. İzolasyon Örnekleri 69 3.1.2 Klonlama Vektörleri ve Kompetan Hücre 69 3.1.3. Besiyerleri69 3. 1. 3. 1. Blood agar 69 3. 1. 3. 2. Brain hearth ınfusion broth69 3. 1. 3. 3. Trypton soy broth ................................................................................................70 3. 1. 3. 4. Kanamisin içeren seçici besiyerinin hazırlanması70 3.1.3. 5. Jelatinaz aktivitesinin belirlenmesi için seçici besiyerinin hazırlanması 70 3. 1. 3. 6. Skim milk powder 70 3.1.4. Kullanılan Solüsyonlar ve Ayraçlar 70 3.1.4.1. EDTA (0,5 M) 70 3.1.4.2. %10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Stok Solüsyonu 71 3.1.4.3. %1,5 Amonyum Persülfat (APS) 71 3. 1. 4. 4. Tris (1M) 71 3. 1. 4. 5. NaCl (5M) 71 3. 1. 4. 6. TBE (Tris, Borik Asit, EDTA, pH:8.0) Buffer71 3. 1. 4. 7. Gel Loading Buffer (6X72 3. 1. 4. 8. TE Buffer (10mM tris+ 1mM EDTA72 3. 1. 4. 9. Sarkozin (%1072 3. 1. 4. 10. Kanamisin Stok Solüsyonu72 3. 1. 4. 11. IPTG Stok Solüsyonu (0.1M).72 3.1.4.12. 1M CaCl2 stok solüsyonunun hazırlanması 73 3.1.4.13. 1M MgCl2 stok solüsyonunun hazırlanması73 3.1.4.14. %10 Gliserol içeren solüsyonun hazırlanması 73 3.1.4.15. Sodyum deoksikloat (%10) 73 3.1.4.16. RIPA Buffer hazırlama74 3.1.4.17. Separasyon Buffer hazırlama74 3.1.4.18. Stacking Buffer hazırlama 74 3.1.4.19. Sample Buffer hazırlama 74 3.1.4.20. Running Buffer hazırlama 74 3.1.4.21. Destaining solüsyon hazırlanması 75 3.1.4.22. Coomassie Brilliant Blue solüsyonunun hazırlanması 75 3.1.5.Genotipik Çalışmalar75 3.1.5.1. 10X Taq Buffer, dNTP, Taq DNA polimeraz 75 3.1.5.2. Primerler75 3.1.5.3.Kullanılan cihazlar81 3.1.5.4. Agarose jel hazırlanışı 81 3.1.5.5. Marker 82 3.1.6. Protein Analizi82 3.1.6.1. Seperasyon jelinin hazırlanması 82 3.1.6.2. Stacking jelinin hazırlanması 83 3.2. Yöntem 83 3.2.1. Cryptosporidium spp. şüpheli dışkı örneklerinden ookist çoklaştırması83 3.2.2. Cryptosporidium spp. tayini için Kinyoun Asit-Fast Boyama 83 3.2.3. Cryptosporidium spp. tayini için İmmunfloresan Antikor Testi 84 3.2.4. Mikroskobi sonrası Cryptosporidium spp. pozitif bulunan örneklerden DNA izolasyonu84 3.2.5. PCR85 3.2.5.1 PCR miksinin hazırlanması 85 3.2.5.2. Amplikonların elektroforez tankına yüklenmesi 87 3.2.5.3. Yürütme87 3.2.5.4. Görüntüleme ve değerlendirme 87 3.2.6. Klonlama 88 3.2.6.1. pET28a içeren Escherichia coli BL21 suşundan plazmit ekstraksiyonu88 3.2.6.2. pET28a plazmidi ile klonlanacak genleri içeren amplikonların restriksiyonu 89 3.2.6.3. Presipitasyon90 3.2.6.4. pET28a plazmidi ve klonlanacak genleri içeren (cryptopain, cryptostatin ve CP 39) amplikonların ligasyonu 90 3.2.6.5. Kimyasal Transformasyon Yolu ile E.coli BL21 hücrelerinin hazırlanması91 3.2.6.6. Kimyasal Transformasyon91 3.2.6.7. İnsert Alan Rekombinant plazmidleri içeren kolonilerin seçimi ve doğrulanması 92 3.2.6.8. sekans analizi92 3.2.7. SDS92 3.2.7.1. Kısmi protein saflaştırması92 3.2.7.2. SDS jelinin hazırlanması 93 3.2.7.3. Örneklerin hazırlanması 95 3.2.7.4. Örneklerin jelde yürütülmesi95 3.2.7.5. Jel boyama 95 3.2.8. Rekombinant Olarak Üretilen Proteinlerin Jelatinaz Aktivitesinin Değerlendirilmesi 96 4. BULGULAR 97 5. TARTIŞMA113 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 121 KAYNAKLAR122 ÖZGEÇMİŞ153 | tr_TR |
| dc.language.iso | tur | tr_TR |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | tr_TR |
| dc.subject | Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium parvum, sistein proteaz, klonlama, rekombinant üretim | tr_TR |
| dc.title | Trichomonas vaginalis ve Cryptosporidium parvum PARAZİTLERİNDE BULUNAN SİSTEİN PROTEAZ GENLERİNİN KLONLANMASI VE REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ | tr_TR |
| dc.title.alternative | CLONING AND RECOMBINANT PRODUCTION OF CYSTEINE PROTEASE GENES IN THE PARASITES OF Trichomonas vaginalis and Cryptosporidium parvum | tr_TR |
| dc.type | doctoralThesis | tr_TR |
| dc.contributor.authorID | https://orcid.org/0000-0003-2736-0316 | tr_TR |
| dc.contributor.department | Parazitoloji (Tıp) Anabilim Dalı | tr_TR |
| Appears in Collections: | Doktora | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| ZEYNEP ERDEM AYNUR_DR.pdf | Zeynep Erdem Aynur Doktora Tez Çalışması 2020 | 2.74 MB | Adobe PDF | View/Open |
| ZEYNEP ERDEM AYNUR_DR.pdf | Zeynep Erdem Aynur Doktora Tez Çalışması 2020 | 2.74 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.