Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11607/3919
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorBozdoğan, Bülent-
dc.contributor.authorSalih, Hanife-
dc.date.accessioned2020-09-24T12:57:41Z-
dc.date.available2020-09-24T12:57:41Z-
dc.date.issued2020-09-24-
dc.date.submitted2020-08-21-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11607/3919-
dc.description.abstractAntibiyotikler en yaygın kullanılan ilaçlar arasındadır. Enfeksiyonların tedavisinde kullanıldığı gibi besi hayvanları ve bitkilerin büyümelerini hızlandırmak amacı ile de kullanılmaktadır. Genellikle vücuttan atıldıktan sonra da aktif halde kalan antibiyotiklerin bilinçsiz kullanımı antibiyotik direncinin gelişmesinde önemli bir faktördür. Son yıllarda çoklu antibiyotik direncine sahip suşların görülme sıklığı ve yaygınlığı artmaktadır. Antibiyotik direncine sebep olan genlerin karakterizasyonu direnç sorununun ortaya konması ve mücadele yollarının belirlenebilmesi açısından önemlidir. Bu çalışmanın temel amacı antibiyotik direncine neden olan bilinen veya bilinmeyen genlerin klonlanmasına imkan veren bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, antibiyotik direnç genlerinin klonlanmasında oryantasyon sorunu yaşanmaması için çoklu klonlama bölgesinin her iki yönünden de ekspresyon sağlanabileceği vektör geliştirilmesi hedeflenmiştir. Oluşturulan pRTA vektörünün omurgası pUC19 vektöründen faydalanılarak invers PCR yoluyla elde edilmiştir. Dizayn edilen promotör ve RBS sekansı, vektör omurgasında hedeflenen lokasyona yerleştirilmiştir. Dual promotöre sahip vektörde promotör ve RBS’nin yerleşmesi ve fonksiyon gördüğünün belirlenmesi sekans analizi ve klonlama çalışmaları ile tespit edilmiştir. Geliştirilen klonlama yönteminde kullanılan 3’uçlarınında tek adenin bazı uzantısı bulunduran vektör, pRTA vektöründen PCR yoluyla elde edilen bir vektördür ve “AT vektörü” olarak adlandırılmıştır. Eritromisin direncine sahip S. aureus suşunun total DNA’sı fragmentaz enzimi ile rasgele parçalanıp istenen boyutlarda fragmentler oluşturulmuştur. Fragmentlerin 3’ uçlarına AT vektörüne bağlanabilmesi için timin bazı eklendikten sonra fragmentler ve vektör ligasyonla bağlanmıştır. Oluşan ligand E. coli DH10B suşuna aktarılmış ve 200 μg/ml eritromisin içeren besi yerinde seçilmiştir. Çoğalan kolonilerdeki insertlerin sekans analizi yapıldığında direnç sağlayan genin ermC olduğu ve plazmid üzerinde taşındığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak dual promotöre sahip ve mavi-beyaz seçilime imkan veren bir vektör geliştirilmiştir. Geliştirilen bu vektörden elde edilen AT vektörü plazmid izolasyonuna kıyasla daha verimli şekilde PCR yoluyla elde edilmiştir. Klonlanacak direnç genlerini içeren fragmanlar fragmentaz enzimi ile rasgele lokasyonlardan parçalanarak direnç geninin içinden kesilme ihtimalini düşürmüştür. Ayrıca direnç geninin klonlanabilecek boyutta fragmanlar oluşturmasını sağlayarak klonlama başarısını arttırmıştır. Bu tezde, yeni bir vektör ve bilinen ve bilinmeyen direnç genlerinin klonlanması için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.tr_TR
dc.description.sponsorshipBu tez Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TPF-19052 proje numarası ile desteklenmiştir.tr_TR
dc.description.tableofcontentsKABUL VE ONAY SAYFASI i TEŞEKKÜR ii İÇİNDEKİLER iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vii ŞEKİLLER DİZİNİ viii RESİMLER DİZİNİ ix TABLOLAR DİZİNİ x ÖZET xi ABSTRACT xiii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 2 2.1. Antibiyotikler ve Etki Mekanizmaları 2 2.1.1. Hücre Duvarını Hedefleyen Antibiyotikler 3 2.1.1.1. Beta-laktamlar 4 2.1.1.2. Glikopeptidler 4 2.1.2. Protein Sentezini İnhibe Eden Antibiyotikler 4 2.1.2.1. 30S alt ünite inhibitörleri 5 2.1.2.1.1. Aminoglikozidler 5 2.1.2.1.2. Tetrasiklinler 5 2.1.2.2. 50S alt ünite inhibitörleri 5 2.1.2.2.1. Kloramfenikol 5 2.1.2.2.2. Makrolidler 6 2.1.3. DNA Replikasyon İnhibitörleri 6 2.1.3.1. Florokinolonlar 6 2.1.4. Folik Asit Metabolizması İnhibitörleri 6 2.1.4.1. Sülfonamidler ve trimetoprim 6 2.2. Antimikrobiyal Direnç 7 2.2.1. Antimikrobiyal Direncin Ortaya Çıkışı 8 2.2.1.1. Mikroorganizmlarda antimikrobiyal direncin gelişimi 10 2.2.1.2. Bireylerde dirençli bakteri kolonizasyonu 11 2.2.1.3. Antibiyotiklere direnç ve yayılması 11 2.2.2. Antibiyotik Direnç Tipleri 12 2.2.2.1. İntrinsik direnç 12 2.2.2.2. Kazanılmış direnç 13 2.2.2.2.1. Kromozomal direnç 13 2.2.2.2.2. Plazmidlere bağlı direnç 14 2.2.2.2.3. Transpozonlara bağlı direnç 15 2.3. Antibiyotik Direnç Mekanizmaları 15 2.3.1. Antibiyotik Modifikasyonu veya Degredasyonu 15 2.3.2. Antibiyotiklerin Hücre İçi Akümülasyonunun Engellenmesi 16 2.3.3. Antibiyotik Tutulması 17 2.3.4. Hedef Değiştirme / Baypas / Koruma Mekanizmaları 17 2.4. Moleküler Klonlama 19 2.4.1. TA Vektör Üretimi 23 2.4.2. DNA Fragmantasyon Yöntemleri 23 2.4.2.1. Fiziksel yolla DNA fragmantasyonu 23 2.4.2.2. Enzimatik yollarla DNA fragmantasyonu 24 2.4.2.3. Kimyasal yolla fragmantasyon 24 3. GEREÇ VE YÖNTEM 25 3.1. Gereç 25 3.1.1. Cihazlar 25 3.1.1.1. Thermal cycler 25 3.1.1.2. Thermo shaker 25 3.1.1.3. Otoklav 25 3.1.1.4. Santrifüj 25 3.1.1.5. Etüv 26 3.1.2. Bakteri Suşları 26 3.1.2.1. Esherichia coli DH10B suşu 26 3.1.2.2. Metisilin Dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ADU1 suşu 26 3.1.2.3. Metisilin Dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ADU2 suşu 26 3.1.3. Kullanılan Plazmidler 27 3.1.3.1. pUC19 plazmidi 27 3.1.4. Çalışmada Kullanılan Besiyerleri ve Çözeltiler 27 3.1.4.1. Tripton soya agarı 27 3.1.4.2. Tripton soya broth 27 3.1.4.3. AXI besiyeri 27 3.1.4.4. Brain heart (Infusion) agar 28 3.1.4.5. Brain heart (Infusion) broth 28 3.1.4.6. Skim milk powder 28 3.1.4.7. Agaroz jel elektroforezi 28 3.1.5. Çalışmada Kullanılan Enzimler 29 3.1.5.1. Taq polimeraz 29 3.1.5.2. Restriksiyon enzimleri 29 3.1.5.3. Modifikasyon enzimleri 29 3.1.5.4. Fragmantasyon enzimi 29 3.1.6. Çalışmada Kullanılan Programlar 29 3.2. Yöntem 30 3.2.1. pRTA Vektörünün Oluşturulması 30 3.2.1.1. pRTA vektörünün oluşturulmasında kullanılacak olan vektörün omurgasının eldesi 30 3.2.1.2. pRTA vektörünün promotör-ribozomal bağlanma sekansının dizaynı ve eldesi 32 3.2.1.3. pRTA-omurga ve prom-RBS çift iplikli oligonükleotidinin restriksiyon enzimi ile kesimi 33 3.2.1.4. Saflaştırılmış restriksiyon ürünlerinin ligasyonu 33 3.2.1.5. Ligandın E. coli DH10B suşuna transformasyonu, pRTA vektörünün oluşumunun doğrulanması 34 3.2.1.6. pRTA vektöründe bulunan prom-RBS sekansının etkinliğinin test edilmesi 35 3.2.1.7. pRTA vektöründe prom-RBS varlığının sekans analizi ile doğrulanması 36 3.2.2. Modifiye TA Yöntemi ile pRTA Vektörüne Antibiyotik Direnç Geni Klonlanması 36 3.2.2.1. Eritromisin direncine sahip S. aureus ADU2 suşundan DNA izolasyonu 36 3.2.2.2. Genomik DNA’nın fragmentaz enzimi ile parçalanması 37 3.2.2.3. DNA fragmanlarının 5’ ve 3’ uçlarının kütleştirilmesi 37 3.2.2.4. DNA fragmanlarının 3’ ucuna terminal deoksinükleotidil transferaz enzimi ile ddTTP eklenmesi 38 3.2.2.5. pRTA vektöründen PCR yolu ile AT vektörü oluşturulması 38 3.2.2.6. Eritromisin direnç geninin klonlanması 39 4. BULGULAR 40 4.1. pRTA Vektörünün Oluşturulması 40 4.1.1. pRTA Vektörünün Oluşturulmasında Kullanılacak Olan Vektörün Omurgasının Eldesi 40 4.1.2. pRTA Vektörünün Oluşturulmasında Kullanılacak Olan Promotör-Ribozomal Bağlanma Fragmanının Oluşturulması 41 4.1.3. pRTA Vektör Adaylarının Seçilmesi 42 4.1.4. pRTA Vektörüne Yerleştirilen Prom-RBS Sekansının İşlevselliğinin Doğrulanması 44 4.1.5. pRTA-aac(6')-aph(2')de Prom-RBS Analizi 49 4.2. pRTA Amplikonuna Genomdan Antibiyotik Direnç Geni Klonlanması 51 4.2.1. Antibiyotik Direncine Sahip ADU2 Suşundan Elde Edilen Genomik DNA’nın Fragmantasyonu 52 4.2.2. pRTA Vektörünün PCR ile Çoğaltılması ve AT Vektörünün Oluşturulması 55 4.2.3. AT Vektörü ve Fragmente DNA ile Antibiyotik Direnç Geni Klonlama 56 4.2.4. Klonlanan Eritromisin Direnç Geninin Sekans ile Doğrulanması 58 5. TARTIŞMA 59 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 65 KAYNAKLAR 66 ÖZGEÇMİŞ 73tr_TR
dc.language.isoturtr_TR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesstr_TR
dc.subjectAntibiyotik Direnci, Direnç Geni Klonlama, Klonlama Vektörü, Modifiye TA Klonlamatr_TR
dc.titlepRTA, YENİ BİR VEKTÖR VE TA KLONLAMA: BİLİNMEYEN ANTİBİYOTİK DİRENÇ GENLERİNİN KARAKTERİZASYONU İÇİN YÖNTEMtr_TR
dc.title.alternativepRTA, A NEW VECTOR AND TA CLONING: A METHOD FOR CHARACTERIZATION OF NOVEL ANTIBIOTIC RESISTANCE GENEStr_TR
dc.typemasterThesistr_TR
dc.contributor.authorID0000-0003-2141-0669tr_TR
dc.contributor.departmentAydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoteknoloji Anabilim Dalı (Disiplinlerarası), Moleküler Biyoteknolojitr_TR
Appears in Collections:Yüksek Lisans

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
HANİFE SAĞLIK YL AAA.pdfTez Dosyası2.44 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.