Hücre Modelinde SIRT4 (Sirtuin4)'ün Eksitotoksisiteye Karşı Koruyucu Etkisinin Araştırılması

Abstract

HÜCRE MODELİNDE SIRT4 (SİRTUİN4)’ÜN EKSİTOTOKSİSİTEYE KARŞI KORUYUCU ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

Çolak M. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Programı, Yüksek Lisans Tezi, Aydın, 2020.

Glutamat, merkezi sinir sisteminde birçok nörolojik işleve sahiptir ve beyinde yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Sinir terminallerinde glutamat, yoğun olarak bulunur ve hücre içindeki konsantrasyonu dışındaki konsantrasyona göre çok daha fazladır. Sinir hücre membranının depolarizasyonu ile kalsiyuma bağlı bir süreçte presinaptik sinir uçlarındaki veziküllerden hücreler arası boşluğa glutamat salınır ve postsinaptik nörondaki glutamat reseptörleri uyarılır. Glial hücrelerde yer alan glutamat taşıyıcılarının hücreler arası boşluktan glutamatı toplanmasıyla uyarım bitirilir. Glutamat seviyesinin nöronal boşlukta artışı toksiktir, nöron hasarı ve ölümüne neden olur. Bu durum, glutamata bağlı eksitotoksisite olarak adlandırılır. Eksitotoksisite, travma, serebral iskemi, epilepsi, Parkinson Hastalığı, Alzheimer Hastalığı gibi birçok nörolojik hastalığın altındaki sebeplerdendir. Kainik asit, glutamat analogudur, nörotoksisite oluşturulması için kullanılan kimyasal bir modeldir. Sessiz bilgi düzenleyicisi (Sir) protein ailesinin ilk üyesi olan Sir2’nin homologları sirtüinler olarak adlandırılır. Memelilerde yedi tane sirtüin (Sirt1-7) bulunur. Sirt4, deasetilaz ve ADP-ribosilaz etkinliği gösteren ve mitokondride bulunan memeli sirtüinidir. Sirt4, GDH’ı aracı olarak kullanarak glutamin metabolizmasını düzenler. Bundan dolayı, Sirt4'ün nöronal uyarılar ve eksitotoksisite sırasında artan glutamat seviyesine cevabı düzenleyeceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, N2A hücreleri 10 µM, 50 µM, 200 µM ve 1000 µM’lık kainik asit konsantrasyonlarıyla muamele edildi. Ardından, hücrelerin canlılık seviyeleri MTT testi ile değerlendirildi. 200 µM ve 1000 µM’lık kainik asit konsantrasyonlarında hücre canlılık seviyesinde anlamlı düşüş olduğu belirlendi. Takip eden deneylerde 1000 µM’lık kainik asit konsantrasyonunun kullanılmasına karar verildi. N2A hücrelerinde transfeksiyon yöntemi ile Sirt4 ifadesi arttırıldı ve ifade artışı western blot yöntemi ile gösterildi. Sirt4 ifadesi arttırılmamış (kontrol) ve Sirt4 ifadesi arttırılmış (transfekte edilmiş) N2A hücre grupları 1000 µM konsantrasyonda kainik asit ile muamele edildi. Muamele sonrasında, kontrol N2A, kainik asit muamelesi yapılmış N2A, yalnızca Sirt4 ifadesi arttırılmış ve kainik asit muamelesi yapılmış ve Sirt4 ifadesi arttırılmış olmak üzere dört farklı N2A hücre grubu elde edildi. Bu hücre gruplarındaki canlılık seviyesi MTT testi ile ölçüldü. Kontrol N2A ile kainik asit muamelesi yapılmış N2A grupları arasında yapılan kıyaslamada, kainik asit muamelesi sonucu hücrelerin canlılık seviyelerinde anlamlı bir düşüş gözlendi. Sirt4 ifadesinin arttırılmasının ise hücre canlılığındaki düşüşü azalttığı gözlendi. Ayrıca, bu dört farklı deney grubunda glutamat salınımı 0, 12, 24, 48 saatlik süre için ölçüldü. Kainik asit muamelesi yapılmış ve Sirt4 ifadesi arttırılmış deney grubunda, yalnızca kainik asit ile muamele edilmiş deney grubuna kıyasla, hücre ölümünün daha az olduğu, bu nedenle daha fazla glutamat salınımı yapıldığı gösterildi. Dolayısıyla, Sirt4’ün eksitotoksisiteyi engelleyerek hücre ölümünü azaltabileceği gösterildi.