Please use this identifier to cite or link to this item:
http://hdl.handle.net/11607/3585Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Pilevneli, Hatice | - |
| dc.date.accessioned | 2019-08-22T05:55:21Z | - |
| dc.date.available | 2019-08-22T05:55:21Z | - |
| dc.date.issued | 2019 | - |
| dc.date.submitted | 2019-08-02 | - |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11607/3585 | - |
| dc.description.abstract | Solid tümörlerin karakteristiği olarak bilinen tümör hipoksisi radyoterapi ve kemoterapiye direnç oluşturmakta ve tipik olarak kötü prognozla da ilişkili olarak görülmektedir. PPM1D/Wip1 fosfataz (Protein phosphatase 1D magnesium dependent/wild type p53 induced phosphatase) özellikle genotoksik stresle p53’e bağlı olarak indüklenir ve DNA hasarı sonrası, p53’ün ATM/ATR kinazlarca başlatılan aktivasyonunu kapatmada önemli rol oynayarak DNA hasarı cevabını (DDR) sonlandırır. Wip1 aşırı ifade edildiğinde onkogen özelliği kazanmakta ve DDR ile p53’e bağlı tümör süpresör cevapları (apoptozis ve senesens) inhibe edebilmektedir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda hipoksi koşullarının Wip1 fosfatazı aşırı ifade eden tümörlerde DDR’nin regülasyonunu ve kemoterapiye cevabı nasıl etkilediği konusunda hemen hemen hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle Wip1 fosfatazı aşırı ekspresse ettiği bilinen meme kanseri hücre dizisi MCF-7’de hipoksi koşullarında Wip1’in inhibitörü GSK2830371 (GSK) ile baskılanmasının DNA hasarı cevabının regülasyonunda ve kemoterapötik ajan Doksorubisin’le birlikte apoptozis ve senesens üzerine etkileri araştırılmıştır. MCF-7 hücrelerinde GSK+Doksorubisin uygulamasının hem normoksik hem de hipoksik koşulda sinerjistik etki göstererek apoptozis ve senesensi DDR’ın önemli elemanlarından γH2AX fosforilasyonunu takiben Chk2-p53-p21 aktivasyonuyla artırdığı ve hücre döngüsünün S fazında belirgin bir artış sağladığı tespit edilmiştir. Bu veriler GSK’nın Wip1’i aşırı ifade eden hipoksik tümörlerde de oldukça iyi bir kombinasyon ajanı olabileceğine işaret etmektedir. | tr_TR |
| dc.description.sponsorship | Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TPF-18007 proje numarası ile desteklenmiştir. | tr_TR |
| dc.description.tableofcontents | KABUL VE ONAY SAYFASI i TEŞEKKÜR ii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ ix TABLOLAR DİZİNİ xii ÖZET xiii ABSTRACT xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Normoksi ve Hipoksi 4 2.1.1. Hipoksi ve HIFler 4 2.1.2. HIF1-α’nın Transkripsiyonunu Sağladığı Hedef Genler 7 2.1.3. Hipoksi ve DNA Hasarı Cevabı 9 2.2.2. DNA Hasarı Cevabı 10 2.3. Wip1 Fosfataz 12 2.3.1. Wip1 Fosfatazın DNA Hasarı Cevabındaki Rolü 13 2.4. Çalışmanın Yapılmasının Amacı 19 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 21 3.1. Çalışmada Kullanılan Hücre Dizisi 21 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Besiyeri ve Kimyasallar 21 3.1.2. Çalışmada Kullanılan Antikorlar 22 3.1.3. Çalışmada Kullanılan Malzemeler 22 3.1.4. Kullanılan Kitler ve Problar 23 3.1.5. Kullanılan Cihazlar ve Aletler 23 3.2. Yöntem 24 3.2.1. Hücre Kültürü Çalışmaları 24 3.2.2. Hücrelerin Pasajlanması 24 3.2.3. Hücrelerin Dondurulup Saklanma İşlemi Dondurma Besiyeri İçeriği 25 3.2.4. Hücrelerin Çözdürülüp Kullanılması 25 3.2.5. Hücrelerin Sayım Yöntemi 25 3.2.6. İlaç Stoklarının Hazırlanması 26 3.2.7. Hücrelerin İnkübasyon Koşullarının Hazırlanması 26 3.2.8. Hücre Kültürü Çalışmalarının ve Sonrasında Yapılacak Olan Analizlerin Hazırlanışı 27 3.2.8.1. MCF-7 hücre hattında apoptozisin indüklendiği çalışmaların hazırlanışı 27 3.2.8.2. MCF-7 hücre hattında senesensin indüklendiği çalışmaların hazırlanışı 28 3.2.8.3. Wst-1 testi 28 3.2.8.4. SA-β-Galaktozidaz boyama testi 29 3.2.8.5. Annexin V apoptozis testi 30 3.2.8.6. Hücre döngüsü testi 30 3.2.8.7. H2A.X testi 31 3.2.8.8. Western Blot analizi için yapılan çalışmalar 32 3.2.8.8.1. Protein izolasyonu 32 3.2.8.8.2. Protein miktar tayini 32 3.2.8.8.3. Western Blot analizi 33 3.2.8.8.3.1. Poliakrilamid jelin (SDS-PAGE) hazırlanması 33 3.2.8.8.3.2. Jele yüklenecek protein örneklerinin hazırlanması 34 3.2.8.8.3.3. Elektroforetik yürütme işlemi 34 3.2.8.8.3.4. Yarı-kuru transfer (semi-dry blotting) 35 3.2.8.8.3.5. Membranı bloklama işlemi 35 3.2.8.8.3.6. Membranın primer antikor ile muamelesi 35 3.2.8.8.3.7. Membranın sekonder antikor ile muamelesi 36 3.2.8.8.3.8. Kemilüminesans yöntem ile membranı görüntüleme 36 3.2.8.9. DNA izolasyonu 37 3.2.8.10. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 37 3.2.8.10.1. PCR örneklerinin agaroz jel elektroforezinde yürütülmesi 39 3.2.8.10.2. PCR örneklerinin Sanger sekanslama yöntemiyle sekanslanması 40 3.2.8.11. Real Time PCR analizi (q-PCR) 40 3.2.8.11.1. Taqman gen kopya sayısı analizi 40 3.2.8.12. Total RNA izolasyonu 42 3.2.8.12.1. İzole edilen RNAlara DNaz muamelesi 42 3.2.8.13. Gen ekspresyon analizi 43 3.2.8.13.1. Komplementer DNA(cDNA)sentezi 43 3.2.8.13.2. Gen ekspresyon seviyesinin q-PCR ile belirlenmesi 43 3.2.8.14. Floresan in-situ hibridizasyon(FISH) analizi 44 3.2.8.14.1. MCF-7 hücresinin parafine gömülmesi 44 3.2.8.14.2. MCF-7 hücresinin hematoksilen-eozinle boyanması 45 3.2.8.14.3. MCF-7 hücresinin FISH analizi 45 3.2.9. Grafiklerin Hazırlanışı ve İstatistiksel Analizlerin Belirlenmesi 47 4. BULGULAR 48 4.1. MCF-7 Hücrelerinde PPM1D/Wip1’in Gen Kopya Sayısı Analizi Düzeyi 48 4.2. MCF-7 Hücrelerinde Wip1’in FISH (Floresan In Situ Hibridizasyon) Yöntemiyle Gösterilmesi 48 4.3. MCF-7 PCR ve Sekans Sonuçları 50 4.4. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde Wip1 mRNA Düzeyi 55 4.5. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde HIF1-α mRNA düzeyi 57 4.6. MCF-7 Hücrelerinin Normoksi ve Hipokside Wip1’in GSK2830371 Tarafından İnhibisyonu 57 4.7. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının MCF-7 Hücreleri Üzerinde Etkileri 58 4.7.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 Saat GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının Hücre Canlılığı Üzerine Etkileri 59 4.7.2. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 Saat GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının Apoptotik etkileri 61 4.7.3. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 saat GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının Hücre Döngüsü Üzerine Etkileri 69 4.8. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 72 Saat GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının MCF-7 Hücrelerinde Senesens İndükleyici Etkileri 74 4.8.1. SA-β-Galaktosidaz Boyaması 74 4.8.2. H2A.X Analizi 76 4.8.3. Hücre Döngüsü Analizi 80 4.8.4. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 saat Doxorubicine veya GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulanan MCF-7 Hücrelerinde DDR Analizi 85 4.8.5. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 72 saat Doxorubicine veya GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulanan MCF-7 Hücrelerinde DDR Analizi 92 5. TARTIŞMA 98 5.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde Wip1 Düzeyi 101 5.2. MCF-7 Hücrelerinde Normoksi ve Hipokside Wip1’in GSK2830371 Tarafından İnhibisyonu 102 5.2.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının MCF-7 Hücre Döngüsü Üzerinde Etkileri 104 5.2.2. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının MCF-7 Hücrelerinde Apoptotik etkileri 106 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 113 KAYNAKLAR 115 ÖZGEÇMİŞ 127 | tr_TR |
| dc.language.iso | tur | tr_TR |
| dc.publisher | Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü | tr_TR |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/closedAccess | tr_TR |
| dc.subject | DNA hasarı cevabı, Hipoksi, MCF7, Meme kanseri, Wip1 fosfataz | tr_TR |
| dc.title | Hipoksinin meme kanseri hücre dizisinde Wip1 fosfataz ve ‘DNA hasarı cevabının’ regülasyonu üzerine etkilerinin araştırılması | tr_TR |
| dc.type | masterThesis | tr_TR |
| dc.contributor.department | Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji Yüksek Lisans Programı | tr_TR |
| Appears in Collections: | Yüksek Lisans | |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Hatice Pilevneli- Yüksek Lisans Tezi 2019.doc | 'Tez Dosyası' | 5.1 MB | Microsoft Word | View/Open Request a copy |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.