Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11607/3393
Title: Centaurea zeybekii Wagenitz'nin in vitro çimlenmesi ve mikroçoğaltımı üzerine araştırmalar
Other Titles: Research on in vitro germination and micropropagation of Centaurea zeybekii Wagenitz
Authors: Erdağ, Bengi
Kurt, Serap
Adnan Menderes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Issue Date: 2006
Publisher: Adnan Menderes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Abstract: Bu çalışmada endemik bir bitki olan Centaurea zeybekii Wagenitz'nin in vitro çimlenmesi ve mikroçoğaltımı üzerine araştırmalar yapılmıştır. Türün kapitulumlarından çıkarılan tohumlar (aken meyve) denemelerde başlangıç materyali olarak kullanılmıştır. Çalışma iki aşamada planlanmıştır. Birinci aşamada, farklı in vitro çimlendirme ortamlarının, gibberellik asitin, ışığın ve sıcaklığın çimlenme üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu denemelerde Centaurea zeybekii tohumlarının optimum in vitro çimlenme koşullarının belirlenmesi ve çimlenen fideciklerin dış ortamlara aktarılarak populasyonun ex situ elde edilmiş bireyler kullanılarak güçlendirilmesi hedeflenmiştir. kinci aşamada ise, in vitro koşullarda çimlenen tohumlardan steril fide gelişimi için uygun ortamların belirlenmesinin yanı sıra, bu fidelerin çeşitli kısımlarının eksplant olarak kullanılması ile aksiller ve adventif sürgün oluşumu teşvik edilmeye çalışılmıştır. Kapitulumlardan çıkarılan tohumlara öncelikle canlılık testi yapılmış ve canlılık yüzde olarak belirlenmiştir. Temmuz ve Ağustos aylarında toplanan tohumlara uygulanan tetrazolium testinin sonuçlarına göre, Temmuz ayında toplanan tohumların çok az bir kısmının boyandıkları (%30) ve bu boyanmanın da çok açık renkte olduğu gözlenmiştir. Ağustos ayında toplanan tohumların ise % 98'inin boyandıkları ve çok net olarak kırmızı renk aldıkları görülmüştür. TTC testi sonuçlarına göre Ağustos ayında toplanan tohumların hemen hepsinin canlı oldukları ve uzun bir süre (20şC sıcaklık, %50-60 nemde) canlılıklarını korudukları belirlenmiştir. lk denemede, GA3 destekli ve desteksiz değişik in vitro ortamlar kullanılmış, C. zeybekii türünün in vitro çimlenmesi için en uygun ortam araştırılmıştır. Tohumlar akan çeşme suyu altında yarım saat yıkandıktan sonra, 10 dakika boyunca % 70'lik etil alkolde, ardından 15 dakika % 4.5'luk sodyum hipoklorit solusyonunda tutulup sterilizasyonları sağlandıktan sonra üç defa distile su ile yıkanmıştır. Steril edilen tohumlar farklı konsantrasyonlarda (1, 2 ve 3 mg/L) gibberellik asit içeren ve içermeyen çimlendirme ortamlarına (Sıvı MS, White, B5, vitamin destekli distile su) alınarak, 24±2 şC'de 16/8 saat fotoperiyot koşulları altında kültüre edilmişlerdir. Bu denemenin sonunda en yüksek çimlenme yüzdesinin vitamin destekli distile suya 1 mg/L GA3 ilavesi ile hazırlanmış ortamda olduğu görülürken (% 80), bunu sırasıyla 2 mg/L GA3 ilaveli White (%45) ve B5 (%45) ortamları izlemiştir. Denemenin bundan sonraki aşamalarında maksimum çimlenmenin elde edildiği 1 mg/L GA3 ilaveli distile su ortamı temel ortam olarak kullanılmıştır. kinci denemede çimlenme üzerine ışığın etkisi araştırılmıştır. 1 mg/L GA3 ilaveli distile su ortamlarına ekilen bir grup tohum 16/8 saat fotoperiyoda tabi tutulurken, diğer bir grup karanlıkta 24 ±2 şC'de inkübasyona bırakılmıştır. Denemenin sonunda C. zeybekii tohumları karanlık koşullarda %80 çimlenme gösterirken, aydınlıkta bu oran %78 olarak belirlenmiş ve çimlenme yüzdeleri karşılaştırıldığında ışık ve karanlık uygulamaları arasında önemli bir farklılık bulunmamıştır. Üçüncü denemede tohum çimlenmesi üzerine sıcaklığın etkisi araştırılmıştır. Sterilize edilmiş tohumlar 1 mg/L GA3 ilaveli distile su ortamlarına aktarıldıktan sonra 15, 20, 25, 30 ve 35 şC'lik sıcaklıklarda kültüre edilmişlerdir. 24±2 şC'de inkube edilen tohumlar en yüksek çimlenme yüzdesine sahipken (% 79), bu değerin altında ve üstündeki sıcaklıklarda çimlenme yüzdesinin düştüğü görülmüştür. In vitro koşullarda çimlendirilen (kotiledonları belirmiş) tohumların bir kısmı bahçe toprağı içeren saksılara alınmış ve iklim odası koşullarında yaklaşık 8 ay boyunca yaşatılabilmişlerdir. Çimlenen tohumların diğer bir kısmı ise en uygun gelişim gösterecekleri in vitro ortamın belirlenmesi amacı ile B5, MS ve White ortamlarına aktarılmışlardır. Yaklaşık 8 hafta sonra (dört haftada bir alt kültür edilmiştir) fideciklerin gelişimleri (sürgün boyu, sürgün sayısı, yaprak sayısı, yaprak genişliği, kök boyu, kök sayısı) incelenerek sonuçlar değerlendirilmiştir. Denemelerimizde White ortamına aktarılan fidelerin hemen hepsinin bir ay sonra öldükleri gözlenmiştir. B5 ve MS ortamlarındaki fideler yaklaşık 8 hafta sonra morfolojik kriterler açısından incelendiğinde fide gelişimi için en uygun ortamın MS olduğu sonucuna varılmıştır. Bitki gelişimi için en uygun ortam olarak belirlenen MS ortamında gelişen yaklaşık 4 haftalık steril fideler aksiller sürgün çoğaltımı için, primer köklerinden ayrılarak farklı sitokinin tip ve konsantrasyonlarını (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L BA, 0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L KIN ve 0.001, 0.005, 001 ve 0.02 mg/L TDZ) içeren MS temel besi ortamlarına aktarılmışlar ve 24±2 şC'de 16/8 saat fotoperiyot koşullarının sağlandığı kültür odasına alınmışlardır. 4 haftalık süre sonunda artan sürgün sayıları belirlenerek aksillar sürgün çoğaltımı için en uygun sitokinin tip ve konsantrasyonu, sürgün sayısı ve sürgün boyu açısından değerlendirilmiştir. TDZ içeren ortamlara aktarılan fidelerde aksiller sürgün çoğaltımı teşvik edilmesine rağmen, sürgünlerin kısa boylu kümeler halinde belirdiği ve hemen hepsinin hiperhidrik oldukları görülmüştür. En yüksek çoğalma oranı eksplant başına 14.85 (sürgün/eksplant) sürgün sayısı ile 1 mg/L BA ilaveli MS ortamında elde edilmiştir. Maksimum sürgün boyunun en yüksek ortalaması ise bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen ve 2 mg/L KIN içeren MS ortamlarında elde edilmiştir. KIN ve BA içeren ortamlarda artan sürgün boyuna karşılık, sürgün sayısında bir azalma yani konsantrasyona bağlı olarak sürgün sayısı artışı ile sürgün boyu arasında negatif bir ilişki olduğu gözlenmiştir. Direkt adventif sürgün rejenerasyonu denemelerinde in vitro koşullarda çimlendirilmiş steril fidelerin yaprakları eksplant olarak kullanılmıştır. ki aylık steril fidelerin yaprakları aksiller tomurcukları olmaksızın abaksial yüzleri ortamla temas edecek şekilde BA (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L), KIN (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L) ve TDZ (0.001, 0.005, 0.01ve 0.02 mg/L) içeren ve içermeyen MS ortamlarında kültüre edilmişlerdir. TDZ ilaveli ortamlarda yüksek oranda kalluslaşma görülmüştür. Kalluslaşma oranları 0.001 mg/ L TDZ'de % 90, 0.005 mg/ L ve 0.01 mg/L TDZ'de % 100'ü bulurken, bu oran 0.02 mg/L TDZ'de %47.5' e düşmüştür. BA ilaveli ortamlarda ise kalluslaşma oranları; 0.5 mg/L BA'da %52.5, 1mg/L BA'da %27.5 ve 2 mg/L BA' da ise %35 oranındadır. 0.2 mg/L BA ilaveli ortamlarda kalluslaşma oranı düşük (% 5) olmasına rağmen, organogenik cevabın nodüler kallus halinde belirmesi ve alt kültürlemeler ile bu durumun değişmemesi nedeniyle bu sitokinin tipi de direk adventif sürgün rejenerasyonu için etkisiz bulunmuştur. KIN ilaveli ortamlarda ise düşük oranlarda kalluslaşma görülmüştür. Kalluslaşma oranları 0.2 mg/L KIN'de % 5, 0.5 mg/L KIN'de % 2.5, 1 mg/L KIN'de % 4 iken, 2 mg/L KIN içeren ortamda kalluslaşma görülmemiştir. Denenen tüm konsantrasyonlarda yaklaşık iki hafta sonra yaprakların yüzeylerinde orta damara yakın yerlerde sürgünler belirmeye başlamış (küçük yaprak çıkışı) ve iyi gelişmiş sürgünler 6. haftanın sonunda gözlenmiştir. Direkt sürgün rejenerasyonu gözlenen ortamlarda eksplantların ortamla temas ettiği kısımlarında kalluslaşma görülmüş ancak bu kalluslar zamanla karararak etkinlik göstermemişlerdir. Eksplant başına en yüksek sürgün sayısı 1 mg/L KIN içeren ortamda (6.2 sürgün/eksplant) elde edilmiştir. Maksimum sürgün boyunun en yüksek ortalaması da (4.17 cm) yine bu ortamda gözlenmiştir. Sonuç olarak C. zeybekii türünün in vitro elde edilmiş steril fide yapraklarının eksplant olarak kullanılması ile direkt adventif sürgün rejenerasyonu için 1 mg/L KIN ilaveli MS ortamının eksplant başına en yüksek sürgün sayısı ve maksimum sürgün boyu açısından en iyi ortam olduğunu söylemek mümkündür. Aksiller ve adventif sürgün oluşumu denemelerinden elde edilen sürgünler stok kültürden ayrılarak köklenmeleri için 0.5, 1, 2 ve 5 mg/L IAA, IBA, NAA içeren MS ve ½ MS ortamlarına alınmıştır. MS ve ½ MS ortamları arasında köklenme teşviki açısından belirgin bir farklılık görülmemiştir. Ancak köklenme son derece düşüktür ve sürgünlerin sadece %15'i 0.5 mg/L IBA ilaveli ortamlarda köklendirilebilmiştir. Köklenen bitkicikler dış ortamlara kademeli bir şekilde aktarılarak aklimatize edilmiştir.
In this study, in vitro germination and micropropagation of Centaurea zeybekii had been investigated. Achenes from the capitula were used as initial explants in the experiments. The experiments were divided into two steps. At the first, effects of different in vitro media with gibberellic acid, illumination, temperature on germination were investigated. In these experiments, determination of optimum in vitro germination conditions for seeds of C. zeybekii and reinforcement of natural population with a support from seedlings acclimated to natural conditions have been aimed. At the second step, determination of appropriate medium for sterile seedlings from in vitro germinated seeds and induction of axillary and adventitous shoot formation by using some parts of these seedlings have been strived out. Viability tests were applicated to the seeds and results were shown as % of total number. According to tetrasolium test results of seeds which were collected in July and August, seeds of July were less (pale red) tinged (some parts were not tinged) and the percentage was 30 %. The seeds of August were almost completely tinged (red) and the percentage was 98 %. According to TTC tests, seeds collected in August were almost completely alive (survive long time under 20ºC temperature 50- 60 % humidity conditions) In the first experiment, two different in vitro media (with GA3 and not) were used to describe the most proper medium for the germination. Achenes were sterilized by using a procedure of 70 % ethanol for 10 min. 4,5 % hypochlorite for 15 min. and then they were washed three times with distilled water after the first washing under tap water for 30 minutes. Sterilized seeds were cultured under 24±2 ºC 16/8 h photoperiod conditions by transferring them to germination media (liquid MS, B5, vitamine supported distilled water) containing gibberellic acid in different concentrations and without gibberellic acid. At the result of this experiment, the highest germination rate (80 %) was in distilled water containing 1 mg/L GA3 and followed by White (45 %) containing 2 mg/L GA3 and B5 (45 %). In the later steps of the experiment, distilled water containing 1 mg/L GA3 presented the maximum germination rate was used as main medium. In the second experiment, effect of illumination on germination was investigated. A group of seeds cultured in media containing 1 mg/L GA3 was exposed to 16/8 h photoperiod while the another group was kept in dark under 24±2 ºC condition. Finally, germination rate of C. zeybekii seeds was 80 % under dark condition and it was 78 % under photoperiod condition showing no important difference between the groups. At the third experiment, effect of temperature on germination was investigated. It was found that the highest germination rate was held (79 %) in seeds incubated under 24±2 ºC and germination rate was decreased below and above this temperature. Some of in vitro germinated seeds were transferred to pots and they survived 8 months under growth chamber conditions. Remaining germinated seeds were transferred to B5, MS and White media to determine the in vitro medium for optimum development. Approximately 8 weeks later (subculturing in 4 weeks interval), development of seedlings (shoot length, shoot number, leaf number, leaf width, root length, root number) were evaluated. All of the seedlings which were transferred to White medium died one month later. MS was selected as the most proper medium for seedling development depending on a comparison with B5 medium using morphological criteria after 8 weeks. 4 weeks old seedlings, that were developed on MS media which was determined as the optimum media for seedling development, were separated from primary roots and transferred to MS basal media with different types of cytokinin and concentrations (0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L BA, 0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/L KIN and 0.001, 0.005, 001 and 0.02 mg/L TDZ) for axillary propagation. At the end of 4 week- period, increase in shoot number and shoot length were determined and optimum cytokinin type and concentration for axillary shoot propagation were determined. Inspite of induction of axillary shoot regeneration in seedlings growing in TDZ media, the seedlindgs were developed in short groups having hyperhydricity (nearly in all). The highest propagation rate was obtained in the medium containing 1 mg/L BA with 14.85 shoot per explant. The highest average of the maximum shoot length was obtained in MS media without plant growth regulators but containing 2 mgl KIN. There were decrease in shoot number which is negatively correlated with increase in shoot length in MS media containing KIN and BA. Leaves of in vitro germinated steril seedlings were used as explants in direct adventitous shoot regeneration experiments. Leaves of sterile seedlings (two months old) without axillary buds were cultured in the media with or without BA (0.2, 0.5, 1 and 2 mg/L), KIN (0.2, 0.5, 1 and 2 mg/L) and TDZ (0.001, 0.005, 0.01 and 0.02 mg/L) as their abaxial sides down and contact with the medium.. The highest callus formation rate was observed in the media containin TDZ. Although callus formation rates were 90 % in 0.001 mg/ L TDZ, 100 % in 0.005 mg/ L and 0.01 mg/L TDZ , it was decreased as 48 % in 0.02 mg/L TDZ. In BA containing media, callus formation rates were 52,5 % in 0.5 mg/L, 27,5 % in 1mg/L BA and 35 % in 2 mg/L BA. Although the low percentage of callus formation in 0.2 mg/L BA added medium (5 %), this cytokinin type is found non-efficient for direct adventitious shoot proliferation as organogenic answer appears with only shoot buds and this case continues in the subcultures. Callus formation was also observed in media containing KIN. Callus formation rates were %5 in 0.2 mg/L KIN, 2,5 % in 0.5 mg/L KIN, 4 % in 1 mg/L KIN and no callus formation was observed in the medium containing 2 mg/L KIN. In all concentrations, initiations of shoots (small leaf initiations) close to midrib and well developed shoots were observed at the end of sixth week. In the media having direct shoot regeneration, calli formation in explants on their surfaces having contact with the medium were observed but these calli became brownish in time and showed no activity. The highest number of shoots per explant (6,2 shoot per explant) was obtained from the medium containing 1 mgl KIN. The highest average of maximum shoot length was also observed in this medium. Finally, it is possible to stress that medium containing 1 mgl KIN is the best medium by obtaining maximum shoot length and highest number of shoots per explant for direct adventitous shoot regeneration with explants from in vitro germinated shoot leaves. The shoots from axillary and adventitous shoot formation experiments were transferred to MS and ½ MS media containing 0.5, 1, 2 and 5 mg/L IAA, IBA, NAA for rooting. There was no difference between MS and ½ MS media in rooting but it was very low and only 15 % of total shoots could rooted in medium containing 0.5 mg/L IBA. Rooted plantlets were gradually acclimated to the natural conditions.
URI: http://hdl.handle.net/11607/3393
Appears in Collections:Yüksek Lisans

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
serap_kurt_tez.pdfYüksek Lisans20.33 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.