Cryphonectria parasitica’ nın hipovirülent strainlerinin fenol ve kloroform kullanmaksızın dsrna analizi ile belirlenmesi ve rt-pcr ile tanılanması

Abstract

Kestane Kanseri, Cryphonectria parasitica, Castanea spp., nin önemli bir hastalığı olup dal ve gövdelerde kanserlere yol açmakta ve ağaçların zamanla ölmesine sebep olmaktadır. 1964 yılında İtalya’ da iyileşmekte olan kestane ağaçlarında ilk olarak hipovirulent kanserlerin fark edilmesini takiben biyolojik kontrol ajanı olarak kullanılan dsRNA virüsü içeren hipovirulent strainler belirlenmiştir. Ülkemizde de Karadeniz ve Marmara Bölgeleri kestane alanlarından elde edilen C. parasitica‘nın hipovirulent izolatlarının dsRNA içermiş oldukları belirlenmiştir. Hipovirulent izolatlardaki dsRNA’nın varlığının belirlenmesinde genellikle Morris ve Dodds’un dsRNA izolasyon ve analiz yöntemi kullanılmaktadır. Bu çalışmada ise hipovirulent olabileceği belirlenen C. parasitica izolatlarında dsRNA varlığı belirlemek için Balijja ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntem kullanılmıştır. Diğer izolasyon yöntemlerine kıyasla daha kısa süre gerektirmesi, kullanılan miselyum ve kimyasal madde miktarının daha az olması ve fenol- kloroform içermemesi gibi avantajları nedeniyle gelecekte ülkemiz ve bölgemizde bu konuda yapılacak olan araştırmalara kolaylık sağlaması amacıyla bu çalışma planlanmıştır. Bu amaçla Ege, Karadeniz ve Marmara Bölgelerindeki kestane alanlarından kestane kanseri hastalığı ile bulaşık ağaçların iyileşme belirtisi gösteren kanser yaralarının kabuk dokularından elde edilen ve açık renk-beyaz misel oluşumu gözlenen izolatlar kullanılmıştır. Çalışma kapsamında 68 izolattan 30 tanesi dsRNA ekstraksiyonuna olanak sağlayan Balijja’nın önerdiği yöntemi ile analiz edilmiş ve 25 izolatın dsRNA profili içerdiği belirlenmiştir. dsRNA profili içeren 6 izolat Morris ve Dodds’un yöntemi ile dsRNA varlığı yönünden doğrulanmıştır. Ardından RT-PCR ile 15 izolattan elde edilen dsRNA’ların hipovirüs Cryphonectria hypovirus 1 (CHV-1) olduğu belirlenmiştir.

Chestnut blight, Cryphonectria parasitica, is a serious disease of Castanea spp. and causes bark cankers that progressively kill branches and trunks. Hypovirulent cancers were first identified with the awareness of chestnut trees recovering in Italy in 1964. It has been determined that the hypovirulent isolates of C. parasitica have dsRNA which obtained from chestnut areas of the Black Sea and Marmara regions in our country. The dsRNA isolation and analysis method of Morris and Dodds is usually used to determine the presence of dsDNA in hypovirulent isolates. In this study, to determine the presence of dsRNA in C. parasitica isolates, which may be hypovirulent, method of Balijja and collaborators has been used. Balijja’s method has advantages such as low amount of mycelium and chemicals used according to other isolation method, the phenol-chloroform inclusion and the isolation period of dsRNA can be realized in one day, the study was planned in order to facilitate the future research of our country and region. For this purpose, isolates, were collected from healing cankers of chestnut areas of the Aegean, Black Sea and Marmara, in which light-white micelle formation was observed were used. In this study 30 out of 68 isolates analyzed by Balijja’s and only identified dsRNA profile in 25 isolates. dsRNA-containing 6 isolates were analyzed by method of Morris and Dodds and confirmed the existence of dsRNA. RT-PCR revealed that 25 out of 15 dsRNAs belonged to the hypovirus Cryphonectria hypovirus 1 (CHV-1).