Seasonal dynamics in acrosome reaction induction in ram spermatozoa

Abstract

Koçlarda akrozom reaksiyonunun uyarılması üzerine mevsimsel etkilerin ve ozmotik tolerans limitlerinin incelenmesi amacıyla iki paralel çalışma yürütüldü. Toplam 6 baş ergin koçtan ayda bir kez olmak üzere tüm çalışma süresince kış (Aralık-Şubat), ilkbahar (Mart-Mayıs), yaz (Haziran-Ağustos) ve sonbahar (Eylül-Kasım) mevsimleri süresince (her koç her mevsimde 3 kez ejekülat verdi) sperma örnekleri elektroejekülatör yardımıyla toplandı. Çalışmanın ilk bölümünde akrozom reaksiyonunun uyarılması amacıyla farklı ajanlar, LPC ve CI, kullanıldı. Sperma örnekleri 37°C de 3 saat boyunca inkübe edildiler. LPC veya CI ile uyarıldıktan sonra çeşitli aralıklarla (15, 30, 60, 120 ve 180 dakika) örnekler toplanarak akrozomal bütünlük floresan boyama (FITC-PNA) ile tespit edildi. LPC ve CI ile uyarılan akrozom reaksiyonu oranları farklı mevsimlerde farklı oranlar oluşturdu. Tüm inkübasyon süreleri (15-180 dakika) için akrozom reaksiyonuna giren spermatozoon oranları LPC ve kontrol grupları için kış aylarında maksimum düzeye ulaştı (P<0.05). Ancak, CI ile uyarılan akrozom reaksiyonu oranları inkübasyon süresine bağlılık gösterdi (reakte akrozom oranı 180 dakikalık inkübasyon süresince kademeli olarak yükseldi) ve mevsimlere göre önemli ölçüde değişti. Kış ve yaz aylarında CI ile uyarılarak akrozom reaksiyonuna giren spermatozoon oranları tüm inkübasyon süreleri için daha yüksek (P<0.05) bulundu. Çalışmanın ikinci bölümünde sperma örnekleri farklı ozmotik basınçlara sahip (50,100, 290, 500 ve 1000 mOsm/L) früktoz-sodyum sitrat solüsyonlarına maruz bırakıldılar. Bu örnekler 35°C de 15 dakika boyunca inkübe edildiler. İzoozmotik ve hiperozmotik solüsyonlarda inkübe edilen örnekler (290, 500, 750 ve 1000 mOsm/L) hipoozmotik koşullara yeniden döndürüldüler. Bu ozmotik şok uygulamalarından sonra spermatozoon canlılık oranları ve membran bütünlükleri eosin boyaması ve hipoozmotik şişme testinin kombine kullanıldığı (HE testi) bir metot yardımıyla değerlendirildi. Hipo, izo ve hiperozmotik koşullarda inkübe edilen spermatozoonlarda en düşük (P<0.05) canlı spermatozoon oranları kış mevsiminde elde edildi. Benzer biçimde 50, 100, 290, 500 ve 100 mOsm/L lik solüsyonlarda inkübe edilen örneklerde en düşük (P<0.05) membran bütünlüğü tam ve membran bütünlüğü tam-canlı spermatozoon oranları kış aylarında tespit edildi. Anizoozmotik solüsyonlarda inkübasyon sonrasında canlı, membran bütünlüğü tam ve canlı-membran bütünlüğü tam spermatozoon oranları en yüksek olarak sonbaharda tespit edildi, bununla beraber bu parametrelerin aynı ozmotik inkübasyon koşullarında kış aylarında en düşük olduğu gözlendi. Bu açıdan bakıldığında membran bütünlüğü açısından en iyi mevsimin sonbahar olduğu tespit edildi. Sonuç olarak, LPC be CI un akrozom reaksiyonunun uyarılması için farklı yolakları kullandıkları ve sinyal iletim yolaklarının uyarılmasından sorumlu oldukları belirlendi. Taze, LPC ve CI ile akrozom reaksiyonu uyarılan koç spermatozoonlarında bu çalışmada kış aylarında belirlenen aşırı duyarlılığın bu dönemdeki artan melatonin düzeyleri ile ilişkili olabileceği düşünülebilir. Bununla birlikte, mevsimlerin koç spermatozoonlarının ozmotik toleransları üzerine önemli etki yaptığı görülmüştür. En yüksek fertilite düzeylerine ulaşılan, aşım sezonu olan sonbahar aylarında en geniş ozmotik tolerans sınırlarının belirlenmesinin aslında rastlantısal olmadığı düşünülmektedir.

Two longitudinal studies were conducted to evaluate the seasonal dynamics in acrosome reaction induction and osmotic tolerance limit of ram sperm. Semen was collected using an electroejaculator once a month from 6 mature rams (three ejaculates per each ram per season) throughout study period during winter (Dec-Feb), spring (Mar-May), summer (Jun-Aug) and autumn (Sep-Nov). In study 1 acrosome reaction was induced in vitro by using different inducing agents; LPC and CI. The samples were then incubated in water bath at 37°C for 3 hrs. At various intervals (15, 30, 60, 120 and 180 min) after stimulation with LPC or CI, the acrosomal status of the samples was monitored by using fluorescent staining (FITC-PNA). The AR induced in the presence of LPC or CI showed different pattern in different seasons. The percentage of acrosome reacted sperm was higher (P<0.05) in LPC and control during winter season compared to other seasons at all incubation time intervals (15-180 min). However, CI induced the AR in a time dependant manner (reacted sperm rate gradually increased over incubation time of 180 min) and it varied dramatically between seasons. During winter and summer seasons, the CI-induced AR remained higher (P<0.05) at all incubation time points. In study 2 the sperm samples were exposed to fructose-sodium citrate solutions of different osmolalities (50,100, 290, 500 and 1000 mOsm/L). The samples were then incubated at 35°C for 15 min. The isosmotic and hyperosmotic incubation samples (290, 500, 750 and 1000 mOsm/L) were returned to hypo-osmotic condition. After osmotic challenges, the sperm viability and membrane integrity were estimated using a combined hypo-osmotic swelling and eosin test (HE test). The live sperm percentage was recorded lowest (P<0.05) at all hypo, iso and hyperosmotic conditions during winter season. Similarly lowest (P<0.05) intact and live-intact sperm percentages were observed in 50, 100, 290, 500 and 100 mOsm/L conditions during winter season. The highest membrane integrity rate in terms of live, intact and live-intact sperm proportions after exposure to anisoomotic media were recorded in autumn season whereas, these parameters were lowest during winter season under the same osmotic conditions in this studyBest membrane integrity was recorded during autumn season. In conclusion both LPC and CI are use different pathways for AR induction and responsible to provoke signaling transduction pathway. It can be hypothesized that the extra receptivity of ram sperm to undergo AR in fresh, LPC or CI treated groups during winter season as observed in the present study, might be due to an expected increase in melatonin during this season. Moreover, season has significant influence on osmotic tolerance limit of ram sperm. The best osmotic tolerance during autumn might be the reason of better fertility in breeding season in ram.