Karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması için moleküler baskılanmış kriyojellerin hazırlanması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, sığır kanından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması için moleküler baskılanmış poli(HEMA-MAH) kriyojeller sentezlenmiştir. Sentezlenen kriyojellerin karakterizasyonu şişme, makrogözeneklilik ve akış hızı denemeleri ve FTIR, SEM, yüzey alanı ve elementel analiz ölçümleri yapılarak gerçekleştirilmiştir. Kriyojellerin şişme oranının 8.01 g H2O/g olduğu makrogözenekliliğin ise % 70 civarında olduğu bulunmuştur. kriyojel makrogözenekliliğinin artışı ile akış hızı da artmıştır. Kriyojel yapısına MAH monomerinin katıldığı elementel analiz ve FTIR analizleri ile gösterilmiş ve sentezlenen kriyojelin yüzey özellikleri SEM ile incelenmiştir. Kriyojelin oldukça gözenekli olduğu ve sünger benzeri bir morfolojiye sahip olduğu bulunmuştur. Karbonik anhidraz baskılanmış kriyojellerin yüzey alanı BET ölçümleri ile 29.3 m2/g olarak bulunmuştur. Maksimum karbonik anhidraz adsorpsiyonu pH 6.0 MES tamponu ile elde edilirken (3.16 mg/g kriyojel), sıcaklığın adsorpsiyon üzerine etkili olmadığı bulunmuştur. Artan tuz derişimi ile adsorpsiyon kapasitesi azalırken kromatografik akış hızı 4 mL/dak'ya çıkarıldığında adsorpsiyon kapasitesi şiddetli bir şekilde azalmıştır. Adsorplanan karbonik anhidrazın floresans spektrumu alınarak üç boyutlu yapısında bir değişiklik olmadığı gözlenmiştir. Kriyojellerin tekrar kullanılabilirliği 10 döngü boyunca incelenmiş ve adsorpsiyon kapasitesinde % 10'luk bir azalma meydana gelmiştir. Sentezlenen kriyojelin seçiciliği albumin, hemoglobin, IgG, -globulin ve lizozime karşı incelenmiş ve sırasıyla 15.26, 60.05, 21.88, 17.61 ve 17.42 kat yüksek seçicilik bulunmuştur. Sentezlenen karbonik anhidraz baskılanmış kriyojeller kullanılarak sığır kanından karbonik anhidraz enzimi yaklaşık % 80 verimle ve 84 kat saflaştırılmıştır ve saflık SDS-PAGE ve zimogram ile gösterilmiştir.

In this study, molecularly imprinted poly(HEMA-MAH) cryogels were synthesized and used for purification of carbonic anhydrase from bovine blood. Cryogels were characterized by its swelling degree, macroporosity, flow rate and FTIR, SEM, surface area and elemental analysis. Swelling degree of the cryogel was found to be 8.01 g H2O/g while their macroporosity was about 70 %. Flow rate increased with increasing macroporosity. Incorporation of MAH monomer into cryogel structure was shown with elemental analysis and FTIR. With SEM photographs it was shown that cryogels were highly porous and had sponge like morphology. Their surface area was found to be 29.3 m2/g with BET studies. Maximum carbonic anhydrase adsorption was found to be 3.16 mg/g with MES buffer (pH 6.0) while temperature had no significant effect over the adsorption. Adsorption capacity was decreased with increased chromatographic flow rate to 4 mL/min. Tree-dimensional structure of the enzyme was studied with fluorometric analysis. Cryogels were re-used for 10 cycle and their adsorption capacity decreased only 10 %. Cryogel selectivity were investigated with albumin, hemoglobin, IgG, -globulin and lysozyme and found to be 15.26, 60.05, 21.88, 17.61 and 17.42, respectively. These cryogel used for purification of carbonic anhydrase from bovine blood and it?s purified with 84 fold and 80 % recovery. Purity of the enzyme was shown with SDS-PAGE and zymogram.